人上皮性卵巢癌細胞系側群細胞的腫瘤干細胞樣細胞生物學特性及膜蛋白差異表達的鑒定

尹 婕，潘凌亞，溫儀萍，黃 虹，曾 靖，李曉瑩，韓甜甜，金 瀅，李 艷

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 婦產科， 北京 100730)

上皮性卵巢癌是首位致死性婦科腫瘤。反復復發和化療耐藥的產生是臨床治療上皮性卵巢癌所面臨的主要困難。實體瘤的腫瘤干細胞樣細胞(cancer stem-like cells)為探索腫瘤發生和化療耐藥的機制提供了新的線索。腫瘤干細胞樣細胞具有正常干細胞的多數生物學特性[1]，如自我更新能力、誘導腫瘤發生、抑制藥物敏感性和凋亡等[2]。

不同實體瘤的干細胞樣細胞具有不同的表面標志物。但有一群細胞表面表達一種ABC家族(ATP-binding cassette)膜蛋白ABCG2/BCRP1，能夠外泌雙苯酰亞胺Hoechst33342染料，從而在流式細胞檢測中形成外泌染料側群(side population, SP)現象，因此又稱為SP細胞[3]。SP細胞富含腫瘤干細胞樣細胞，在多種組織和細胞系中被發現和證實，如骨髓、皮膚、肺，以及某些惡性腫瘤，包括肺癌、卵巢癌、膀胱癌、腦癌，等等。許多研究證實SP細胞表達干細胞標志物，具有正常干細胞和腫瘤干細胞樣細胞生物學特性[4-8]。

目前，尚無明確的特異性的上皮性卵巢癌腫瘤干細胞樣細胞表面標記蛋白，運用SP細胞篩選的手段富集卵巢癌腫瘤干細胞樣細胞，從而進行相關生物學特性的鑒定。本研究通過流式分選，篩選上皮性卵巢癌細胞系SP細胞，鑒定其腫瘤干細胞樣細胞的相關生物學特性，如增殖與分化能力、克隆形成能力、耐藥性及小鼠致瘤能力，并運用定量蛋白質組學技術檢測SP細胞中差異表達蛋白，為后續篩選和鑒定特異性上皮性卵巢癌干細胞樣細胞表面標記蛋白提供分子基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人上皮性卵巢癌細胞系SKOV3和A2780(中國醫學科學院北京協和醫學院基礎醫學研究所細胞中心)；NOD/SCID小鼠(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所)；細胞培養基HG-DMEM培養基(Gibco Invitrogen公司)；Hoechst33342和維拉帕米(Sigma公司)；反轉錄PCR所需試劑、SILAC所需試劑(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:人上皮性卵巢癌細胞系SKOV3和A2780采取貼壁培養，置入含10%胎牛血清的HG-DMEM培養基，細胞培養瓶放入5% CO2、37 ℃、95%濕度細胞培養箱中進行培養。

1.2.2 SP細胞分選、募集:參照文獻進行SKOV3和A2780細胞SP細胞流式分選[9]。簡單來說，將細胞制成1×106/mL單細胞懸液后，進行Hoechst33342染色，染色條件為37 ℃水浴90 min。對照組在染色同時加入50 μmol/L維拉帕米以阻斷染料外泌通路。流式分選前加入2 μg/mL PI染色液標記死細胞。用Moflo分選儀進行SP細胞分析及分選。

收集SP細胞進行體外貼壁培養，至對數生長期后再次進行兩次或3次分選，分析SP細胞比例變化，直至能夠獲得穩定比例的SP細胞。

1.2.3 細胞形態學觀察和生長曲線繪制:貼壁細胞用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液鋪至培養板內的小玻片上，貼壁培養72 h后，沖洗細胞爬片，甲醛固定后，吉姆薩染色，光學顯微鏡下觀察形態。MTT法測定細胞生長曲線：細胞接種于96孔板內，每孔500個細胞，每天取3孔，加入5 mg/mL MTT 20 μL，細胞裂解后，酶標儀測定540 nm吸光值(A540)，以吸光值為縱坐標，天數為橫坐標，繪制生長曲線。

1.2.4 細胞藥物敏感實驗[10]:采用MTT法測定細胞對卵巢癌一線化療藥物紫杉醇和順鉑的敏感性。并計算藥物對細胞的抑制率(inhibition rate) =[(A對照-A實驗)/A對照]×100%。將非SP(non-SP, NSP)細胞耐藥指數(resistance index, RI)設置為1，SP細胞RI=SP細胞IC50/NSP細胞IC50。

1.2.5 細胞克隆形成能力:運用流式分選技術，將單細胞接種于96孔板內，每孔一個細胞，加入含10%胎牛血清的HG-DMEM 100 μL，置入37 ℃、5% CO2、95%濕度細胞培養箱中培養7～10 d，計算單細胞克隆數和單細胞克隆形成率(單細胞克隆形成率=克隆形成數/96×100%)。實驗重復3次。

1.2.6 反轉錄PCR:運用Trizol提取細胞總RNA，反轉錄試劑盒合成cDNA，再進行PCR擴增。擴增基因及引物序列詳見表1。

表1 PCR引物序列及擴增循環Table 1 Primer sequences and amplification cycle for PCR

1.2.7 細胞NOD/SCID小鼠致瘤能力觀察:選擇5周齡、體質量14～16 g雌性NOD/SCID小鼠進行SP細胞致瘤能力檢測。SP和NSP細胞制成1×105個細胞(體積為0.2 mL)混懸液，注射于小鼠肩胛骨皮下。觀察各組裸鼠狀態、腫瘤形成情況。觀察終止指標：肉眼可見腫瘤形成。

1.2.8 定量蛋白質組學技術(細胞培養穩定同位素標記)檢測差異表達膜蛋白:運用細胞膜蛋白細胞培養穩定同位素標記(stable isotopic labeling by amino acids in cell culture, SILAC)試劑進行本部分實驗[11]，同位素標記和細胞膜蛋白提取均參照Invitrogen公司SILAC膜蛋白試劑盒說明書進行。在穩定SP細胞比例的SKOV3和A2780細胞培養基中摻入普通輕型賴氨酸或[U-13C6]重型賴氨酸，細胞培養傳6代后進行SP細胞分選，篩選出含[U-13C6]重型賴氨酸的SP細胞和含輕型賴氨酸的NSP細胞。1∶1比例混合兩種細胞后，提取細胞膜蛋白，測定蛋白濃度，進行蛋白質電泳分離、酶切和質譜分析鑒定[12]，測算含重型(H)氨基酸和含輕型(L)氨基酸的肽段強度比值(H/L值)，分析細胞內顯著高表達和低表達蛋白。差異表達判斷標準：分選重型賴氨酸(H)標記的SP細胞和天然輕型賴氨酸(L)標記的NSP細胞，若H/L比值大于1，蛋白表達上調；若H/L比值小于1，蛋白表達下調。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行數據統計，連續性數值均值比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 成功分選和募集SKOV3和A2780細胞系SP細胞

運用流式細胞分選技術能夠成功分選出A2780、SKOV3細胞系SP細胞，首次分選中，SP比例均低于0.5%，二次分選時SKOV3和A2780細胞系SP細胞比例可達5%～6%；A2780 SP細胞在經過3次分選時則最高可達15%(圖1)，并且比例穩定在一定水平。

圖1 流式分選人上皮性卵巢癌細胞系SKOV3、A2780 SP細胞Fig 1 SP cells sorting of human epithelial ovarian cancer cell lines SKOV3 and A2780 through flow-cytometry

2.2 SP細胞腫瘤干細胞樣細胞生物學特性鑒定

2.2.1 SP和NSP細胞形態觀察和生長曲線比較:SP和NSP細胞經過貼壁培養，染色后光學顯微鏡下觀察，形態學差異不顯著(圖2A)。SP細胞生長顯著快于NSP細胞，A2780、SKOV3細胞SP細胞均較NSP細胞較早進入倍增期(圖2B)。

圖2 SKOV3、A2780 SP和NSP細胞形態學和生長曲線Fig 2 Morphology (A, ×100)and growth curve (B) of SKOV3 and A2780 SP and NSP cells

2.2.2 克隆形成能力:SKOV3和A2780細胞系SP細胞克隆形成率平均值分別為18.75%和39.58%，均顯著高于NSP細胞(7.64%和26.39%)(P<0.05)(圖3A)。

2.2.3 SP細胞對紫杉醇和順鉑的敏感性差:SKOV3細胞系SP細胞對紫杉醇耐藥指數(RI)為2.894±0.582，顯著高于NSP細胞(P<0.05)；對順鉑耐藥指數為1.402±0.042，同樣顯著高于NSP細胞(P<0.01)。

A2780細胞系SP細胞同樣表現出對紫杉醇和順鉑的耐藥性，RI分別為1.422±0.072和1.173±0.038，顯著高于NSP(均P<0.01)(圖3B)。

2.2.4 SP細胞內其他干細胞相關基因檢測:SKOV3細胞SP細胞Oct-4、ABCG2基因表達顯著上調，β-catenin基因表達無顯著變化；而A2780細胞SP細胞內ABCG2、β-catenin表達顯著上調(圖3C)。

2.2.5 小鼠致瘤能力檢測:SKOV3和A2780細胞系SP細胞在NOD/SCID小鼠體內致瘤能力明顯強于NSP細胞。每組細胞接種3只NOD/SCID小鼠，SKOV3 SP細胞NOD/SCID小鼠致瘤時間分別為10、11和15 d，NSP細胞在連續觀察2個月內無成瘤。A2780 SP細胞小鼠致瘤時間分別為20、21和18 d，NSP細胞在35 d后才開始成瘤(圖3D)。

A.cell clone forming rate=clone forming C.expression of cancer stem-like cells associating genes, including Oct-4, β-catenin and ABCG2; D.xenograft ability of SP and NSP cells in NOD/SCID mice;scale bar=5 mm;*P<0.05, **P<0.01 compared with NSP group圖3 SP細胞腫瘤干細胞樣生物學特性鑒定Fig 3 Validation of tumor stemness biological characteristics of SP cells

2.3 SP細胞內顯著差異表達膜蛋白的檢測

SKOV3和A2780細胞內表達差異蛋白質共1 561個和1 989個，其中SKOV3細胞SP細胞中表達上調的蛋白質有920個，表達下調的蛋白質627個。SKOV3 SP細胞內H/L比值≥5的蛋白質有34種，為顯著高表達蛋白質，其中12種蛋白質同時在A2780 SP細胞內高表達，包括CD59、TMEM30a等細胞表面膜蛋白；H/L≤0.3的蛋白質有35個，為SP細胞內顯著表達下調的蛋白，其中13種蛋白質在A2780 SP細胞內的表達也下調(表1，2)。

表1 SKOV3、A2780細胞系SP細胞膜蛋白表達顯著上調的蛋白質Table 1 Up-regulated expressed membrane proteins in both SKOV3 and A2780 SP cell lines

表2 SKOV3、A2780細胞系SP細胞表面膜蛋白表達顯著下調的蛋白質Table 2 Down-regulated expressed membrane proteins in both SKOV3 and A2780 SP cell lines

3 討論

目前有許多研究從尋找和探索上皮性卵巢癌干細胞樣細胞角度出發，研究卵巢癌的發生、發展、轉移、耐藥和復發的機制。多數學者從細胞的克隆形成能力、致瘤能力、分化能力等目前定義腫瘤干細胞的主要標準來鑒定卵巢癌腫瘤干細胞樣細胞的存在[13]。體外實驗證實，極少量卵巢癌細胞能夠在體外形成克隆球， 這是腫瘤干細胞樣細胞的重要特性[14]。此外,從卵巢癌患者的腹水中分離得到腫瘤細胞能夠在裸鼠體內形成具有與來源腫瘤相似組織病理類型的腫瘤組織，并且表達干細胞相關表面標志物CD117[15]。小鼠卵巢癌SP細胞在小鼠模型中具有更強的腫瘤形成能力[4]。

本研究體外實驗驗證了卵巢癌細胞系SKOV3和A2780的SP細胞具有腫瘤干細胞樣細胞特性，如細胞增殖與分化能力、單細胞克隆形成能力、耐藥性和更強的小鼠致瘤能力。這個結論和既往研究[9]一致。SP細胞分選條件較高，且缺乏特異性的標志物，目前尚無法分選出純度較高的卵巢癌腫瘤干細胞樣細胞[16]。

SILAC是一種新的定量蛋白質組學技術，其基本原理是分別用天然同位素(輕型)或穩定同位素(重型)標記必須氨基酸取代細胞培養基中相應的氨基酸，細胞經過5～6個倍增周期的培養后，穩定同位素標記的氨基酸完全摻入到細胞新合成的蛋白質中替代了原有氨基酸[11]。不同標記細胞的蛋白質等比例混合，經過分離、純化后進行質譜鑒定[17]。本試驗選擇的賴氨酸為標記氨基酸，對細胞生長基本無影響，且標記效率高，檢測過程中蛋白質流失少，適合于檢測微量蛋白質的表達。因SP細胞比例較低，分選困難，所以本實驗選擇SILAC進行SP細胞差異蛋白質檢測[18]。

本研究運用SILAC技術檢測出上皮性卵巢癌SP細胞中2 000多個差異表達蛋白，檢測豐度高，并結合兩種細胞系，篩選出12種蛋白分子同時在SKOV3和A2780細胞系SP細胞內高表達，基本為膜蛋白，但大多數為細胞內的膜蛋白，細胞表面膜蛋白種類較少，其中包括TMEM109、CD59、TMEM30a、ATAD3A、ATAD3B等，目前尚無研究證實這幾種蛋白質在卵巢癌發生、發展、轉移、耐藥方面的生物學特性。此外，除高表達蛋白質外，還在兩種細胞系中檢測出13種蛋白質表達下調。后續繼續篩選上皮性卵巢癌腫瘤干細胞樣細胞表面標志物，可能需從SP細胞表達上調膜蛋白著手，進行篩選和鑒定。

本實驗的主要局限性在于缺乏原代上皮性卵巢癌細胞的鑒定，但作為前期實驗，本實驗為探索上皮性卵巢癌腫瘤干細胞樣細胞表面標記蛋白后續深入研究提供了一定的分子基礎。