下調(diào)lncRNA DNM3OS通過靶向miR-193a-3p增強人直腸癌細胞系SW-480的放療敏感性

劉明勝， 陳文超， 蔡穎暢

(衢州市人民醫(yī)院 肛腸外科， 浙江 衢州 324000)

直腸癌(rectal cancer)是常見惡性腫瘤，放射治療是其重要治療手段，聯(lián)合手術(shù)治療可提高患者總生存率[1]。尋找對新輔助治療有預(yù)測性及整體生存有預(yù)后性的生物標志物是直腸癌新輔助治療領(lǐng)域的研究熱點[2]。研究表明長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)與腫瘤的進展有關(guān)，研究報道lncRNA DNM3OS在胃癌組織和細胞系中上調(diào)，可作為胃癌患者預(yù)后不良的指標；抑制DNM3OS可抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[3]。DNM3OS可影響口腔癌細胞的活力和遷移[4]。DNM3OS通過調(diào)節(jié)食管鱗狀細胞癌中的DNA損傷反應(yīng)而賦予放射抗性[5]。然而DNM3OS在直腸癌中的作用及其是否影響直腸癌SW-480的放射敏感性目前還尚未清楚。生物學在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)DNM3OS與miR-193a-3p有結(jié)合位點。研究報道m(xù)iR-193a-3p在直腸癌患者治療前血漿樣品中顯著下調(diào)[6]。miR-193a-3p過表達可抑制結(jié)直腸癌細胞HT-29的增殖，遷移[7]。本實驗旨在研究lncRNA DNM3OS對直腸癌細胞的增殖、凋亡及放射敏感性的影響及其機制是否與miR-193a-3p有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本: 2015年6月至2020年6月衢州市人民醫(yī)院收治的具有完整臨床病理資料的直腸癌患者30例，全部患者經(jīng)病理檢查確診，通過手術(shù)切除其癌組織和癌旁組織；患者均知情且簽署知情同意書。本實驗經(jīng)本院倫理委員會審查批準(批準文號：院字0122019)。

1.1.2 細胞與試劑：人直腸癌細胞系SW-480(ATCC)；RPMI-1640完全培養(yǎng)基(Gibco公司)；熒光定量PCR試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司)；四甲基偶氮唑鹽比色法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒(日本同仁研究所)；凋亡檢測試劑盒(艾美捷科技有限公司)；蛋白裂解液(上海源葉生物科技有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(AAT Bioquest公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組： SW-480細胞用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞，將DNM3OS干擾表達載體及陰性對照、miR-193a-3p模擬物及陰性對照轉(zhuǎn)染至SW-480細胞中，記為si-DNM3OS組、si-NC組、miR-193a-3p組、miR-NC組；將DNM3OS干擾表達載體分別與miR-193a-3p抑制劑陰性對照共轉(zhuǎn)染至SW-480細胞中，記為si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組、si-DNM3OS+anti-miR-NC組。si-NC組、si-DNM3OS組、miR-NC組、miR-193a-3p組、si-DNM3OS+anti-miR-NC組、si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組細胞分別用4 Gy的射線照射后，記為4 Gy+si-NC組、4 Gy+si-DNM3OS組、4 Gy+miR-NC組、4 Gy+miR-193a-3p組、4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC組、4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組。

1.2.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測DNM3OS和miR-193a-3p的表達水平：提取組織和細胞RNA，按試劑盒說明進行PCR，以GAPDH和U6為內(nèi)參，用2-△△Ct法計算相對表達量。DNM3OS上游引物序列：5′-CAAGGCTCTCACTTGTCCTG-3′，下游引物序列：5′-CAGCTGGAAACTGACCAAAG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-CTTCCGTGTTCCTACCC-3′，下游引物序列：5′-ACCTGGTCCTCAGTGTAGCC-3′；miR-193a-3p上游引物序列：5′-AACTGGCCTAC AAAGTCCCAGT-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCGTG TCGTGGAGT-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGC AGCACATATAC-3′，下游引物序列：5′-AAAATATGG AACGCTTCACGA-3′。

1.2.3 細胞集落形成實驗檢測細胞放射敏感性： si-NC組、si-DNM3OS組、miR-NC組、miR-193a-3p組、si-DNM3OS+anti-miR-NC組、si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組細胞接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，分別給予0、2、4、6、8 Gy的射線照射，照射后繼續(xù)培養(yǎng)2周，吉姆薩染色后在光學顯微鏡下計數(shù)大于50個細胞的集落。采用GraghPad Prism5擬合細胞存活曲線。

1.2.4 MTT檢測細胞增殖抑制率： 細胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒說明操作，加入MTT溶液和二甲基亞砜，酶標儀檢測490 nm處吸光度(A)值。增殖抑制率=1-A實驗組值/A空白組值×100%。

1.2.5 流式細胞測量術(shù)檢測細胞凋亡： 收集各組細胞，漂洗后按試劑盒說明操作，加入Annexin V-FITC和PI，孵育后上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 Western blot法檢測蛋白表達： 提取各組細胞總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜封閉，然后加入一抗在4 ℃的冰箱中過夜；加入二抗室溫孵育2 h，顯影，成像，分析蛋白條帶灰度值。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒簩NM3OS的野生型和突變型熒光素酶載體分別與miR-NC和miR-193a-3p共轉(zhuǎn)染至SW-480細胞中，按說明書檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 lncRNA DNM3OS和miR-193a-3p在直腸癌組織中的表達

直腸癌組織中DNM3OS表達水平高于癌旁組織，miR-193a-3p表達水平低于癌旁組織(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with adjacent tissues圖1 lncRNA DNM3OS和miR-193a-3p在直腸癌組織中的表達Fig 1 Expression of lncRNA DNM3OS and miR-193a-3p

2.2 抑制lncRNA DNM3OS表達對直腸癌SW-480細胞放射敏感性的影響

與si-NC組比較，si-DNM3OS組DNM3OS表達水平降低(0.39±0.03比1.01±0.04，t=12.225，P<0.05)；不同劑量射線照射后si-DNM3OS組細胞存活分數(shù)降低(P<0.05)，其放射增敏比為1.798(圖2)。

*P<0.05 compared with si-NC group圖2 抑制lncRNA DNM3OS表達對直腸癌SW-480細胞存活分數(shù)的影響Fig 2 Effect of inhibiting the expression of lncRNA DNM3OS on the survival score of rectal cancer SW-480 cells

2.3 抑制lncRNA DNM3OS表達聯(lián)合4Gy照射對直腸癌SW-480細胞增殖和凋亡的影響

si-DNM3OS組SW-480細胞增殖抑制率和凋亡率高于si-NC組，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表達水平低于si-NC組，p21、Bax、cleaved-caspase-3表達水平高于si-NC組(P<0.05)；4 Gy+si-DNM3OS組細胞增殖抑制率和凋亡率高于4 Gy+si-NC組，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表達水平低于4 Gy+si-NC組，p21、Bax、cleaved-caspase-3表達水平高于4 Gy+si-NC組(P<0.05)(圖3)。

A.proliferation inhibition rate; B.apoptosis rate; C.proliferation and apoptosis-related protein expression; *P<0.05 compared with si-NC group; #P<0.05 compared with 4 Gy+si-NC group圖3 抑制lncRNA DNM3OS表達聯(lián)合4 Gy照射對直腸癌SW-480細胞增殖和凋亡的影響Fig 3 Effect of inhibition of lncRNA DNM3OS expression combined with 4 Gy irradiation on the proliferation and apoptosis of rectal cancer SW-480

2.4 lncRNA DNM3OS靶向調(diào)控miR-193a-3p的表達

Starbase預(yù)測顯示lncRNA DNM3OS與miR-193a-3p有結(jié)合位點(圖4A)。WT-DNM3OS與miR-193a-3p共轉(zhuǎn)染后的SW-480細胞熒光素酶活性低于與miR-NC共轉(zhuǎn)染的細胞(P<0.05)(圖4B)。過表達DNM3OS，miR-193a-3p表達水平降低；抑制DNM3OS表達，miR-193a-3p表達水平升高(P<0.05)(圖4C)。

A.binding site of lncRNA DNM3OS and miR-193a-3p; B.cellular luciferase activity; C.lncRNA DNM3OS regulates the expression of miR-193a-3p; *P<0.05 compared with miR-NC group; #P<0.05 compared with pcDNA group; ▲P<0.05 compared with si-NC group圖4 lncRNA DNM3OS靶向調(diào)控miR-193a-3p的表達Fig 4 lncRNA DNM3OS targeting regulated the expression of

2.5 過表達miR-193a-3p對直腸癌SW-480細胞放射敏感性的影響

與miR-NC組比較，miR-193a-3p組miR-193a-3p表達水平升高(2.85±0.14比1.01±0.04，t=12.601，P<0.05)，不同劑量射線照射后miR-193a-3p組細胞存活分數(shù)降低(P<0.05)，細胞放射增敏比為1.701(圖5)。

*P<0.05 compared with miR-NC圖5 過表達miR-193a-3p對直腸癌SW-480細胞存活分數(shù)的影響Fig 5 Effect of over-expression of miR-193a-3p on the survival score of rectal cancer SW-480 cells

2.6 過表達miR-193a-3p聯(lián)合4 Gy照射對直腸癌SW-480細胞增殖和凋亡的影響

miR-193a-3p組細胞增殖抑制率和凋亡率高于miR-NC組，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表達水平低于miR-NC組，p21、Bax、cleaved-caspase-3表達水平高于miR-NC組(P<0.05)；4 Gy+miR-193a-3p組細胞增殖抑制率和凋亡率高于4 Gy+miR-NC組，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表達水平低于4 Gy+miR-NC組，p21、Bax、cleaved-caspase-3表達水平高于4 Gy+miR-NC組(P<0.05)(圖6)。

A.proliferation inhibition rate; B.apoptosis rate; C.proliferation and apoptosis-related protein expression; *P<0.05 compared with miR-NC group; #P<0.05 compared with 4 Gy+miR-NC group圖6 過表達miR-193a-3p聯(lián)合4 Gy照射對直腸癌SW-480細胞增殖和凋亡的影響Fig 6 Effect of over-expression miR-193a-3p combined with 4 Gy irradiation on the proliferation and apoptosis of rectal cancer SW-480

2.7 干擾miR-193a-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA DNM3OS表達對直腸癌SW-480細胞放射敏感性的影響

不同劑量照射后si-DNM3OS+anti-miR-NC組細胞存活分數(shù)低于si-NC組，放射增敏比為1.745，si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組細胞存活分數(shù)高于si-DNM3OS+anti-miR-NC組，放射增敏比為1.140；4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-193a-3p組細胞增殖抑制率和凋亡率低于4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC組，cyclinD1、Bcl-2、caspase-3表達水平高于4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC組，p21、Bax、cleaved-caspase-3表達水平低于4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC組(P<0.05)(圖7，8)。

*P<0.05 compared with 4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC group圖7 干擾miR-193a-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA DNM3OS表達對直腸癌SW-480細胞存活分數(shù)的影響Fig 7 Interfering miR-193a-3p expression reversed the effect of inhibiting lncRNA DNM3OS expression on the survival score of rectal cancer SW-480 cells

綜上所述，抑制lncRNA DNM3OS表達可抑制SW-480細胞增殖，促進細胞凋亡以及增強細胞的放射敏感性，其機制可能與miR-193a-3p有關(guān)。

A.proliferation inhibition rate; B.apoptosis rate; C.proliferation and apoptosis-related protein expression;*P<0.05 compared with 4 Gy+si-DNM3OS+anti-miR-NC group圖8 干擾miR-193a-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA DNM3OS表達聯(lián)合4 Gy照射對直腸癌SW-480細胞增殖和凋亡的影響Fig 8 Interference with miR-193a-3p expression reversed the effect of inhibiting lncRNA DNM3OS expression combined with 4 Gy irradiation on the proliferation and apoptosis of rectal cancer SW-480

3 討論

新輔助放療是局部晚期直腸癌的標準治療模式，但不同患者對放療的反應(yīng)不同，因此，提高患者對其敏感性，對制定個體化的治療策略具有重要意義[8]。研究報道lncRNA DNM3OS可促進視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞增殖，遷移[9]。抑制DNM3OS表達可減少卵巢癌細胞遷移和侵襲[10]。本實驗結(jié)果顯示，直腸癌組織中DNM3OS表達水平升高，表明DNM3OS可能在直腸癌中起促癌作用。轉(zhuǎn)染DNM3OS干擾表達載體后，細胞增殖抑制率和凋亡率升高，表明抑制DNM3OS可抑制SW-480細胞的增殖，并促進細胞凋亡。轉(zhuǎn)染DNM3OS干擾表達載體后并用不同劑量射線照射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞存活分數(shù)降低，表明抑制DNM3OS表達提高了癌細胞對放射射線的敏感性。此外，轉(zhuǎn)染DNM3OS干擾表達載體并用4 Gy的射線照射后細胞增殖抑制率和凋亡率也顯著升高，表明抑制DNM3OS表達的同時用射線照射對SW-480細胞的抑癌作用更強。

研究表明，miRNA也參與調(diào)控結(jié)直腸癌細胞惡性生物學行為[11]。已有研究表明，miR-193a-3p在直腸癌患者血漿中下調(diào)[6]。本實驗結(jié)果顯示，直腸癌組織中miR-193a-3p表達水平降低，與前人研究[6]結(jié)果相符，提示miR-193a-3p可能在直腸癌中起抑癌作用。此外，研究報道m(xù)iR-193a-3p可促進鼻咽癌細胞的放射抗性[12]。本實驗結(jié)果顯示，單獨過表達miR-193a-3p或用射線照射，SW-480細胞增殖抑制率和凋亡率升高，且不同劑量射線照射后，細胞存活分數(shù)降低；表明過表達miR-193a-3p可抑制SW-480細胞增殖，促進細胞凋亡，且可增加細胞的放射敏感性。本實驗還發(fā)現(xiàn)，DNM3OS靶向調(diào)控miR-193a-3p，干擾miR-193a-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA DNM3OS表達對直腸癌SW-480細胞增殖、凋亡及放射敏感性的影響。