遼寧地區(qū)沙門菌整合子與耐藥相關(guān)性研究

張銘琰 耿英芝 于淼 張眉眉

(遼寧省疾病預(yù)防控制中心，沈陽(yáng) 110005)

沙門菌是公共衛(wèi)生學(xué)中具有重要研究意義的腸道細(xì)菌，一直是國(guó)家食品安全重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的目標(biāo)菌之一。近年來，隨著抗菌藥物的大量使用，沙門菌的耐藥率問題日益嚴(yán)重，國(guó)家雖出臺(tái)《遏制細(xì)菌耐藥國(guó)家行動(dòng)計(jì)劃(2016—2020)》等一系列措施，但沙門菌的耐藥程度仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于副溶血性弧菌、蠟樣芽胞桿菌等其他食源性致病菌，給因沙門菌感染引起的疾病治療帶來挑戰(zhàn)。整合子是由1989年被Stock等[1]發(fā)現(xiàn)的一類可移動(dòng)元件，是人類發(fā)現(xiàn)的繼質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子之后的另一種可以使耐藥基因水平傳播的機(jī)制。整合子中含有3個(gè)主要結(jié)構(gòu)，5’端酪氨酸整合酶，可以捕獲外源耐藥基因盒并使其整合到整合子上；中間可變區(qū)，可以攜帶一個(gè)或多個(gè)耐藥基因盒；3’端保守區(qū)。整合子定位于染色體上，可以使攜帶的耐藥基因穩(wěn)定遺傳，使細(xì)菌耐藥性垂直傳播；整合子若定位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子上，可以使耐藥基因跨種屬，使細(xì)菌耐藥性水平傳播[2]。整合子共分6類，以I、II、III類整合子研究居多[3]。鑒于整合子具有隨機(jī)捕獲外源性耐藥基因的特點(diǎn)，能夠使細(xì)菌耐藥基因的水平傳播，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性升高，對(duì)藥物敏感率下降，從而成為研究耐藥相關(guān)性的重要依據(jù)。本研究通過對(duì)來源于食品以及病患的149株沙門菌進(jìn)行整合子類別篩選和基因測(cè)序，分析來自食品與腹瀉患者體內(nèi)的沙門菌整合子及其基因盒的分布情況，探究耐藥性與整合子之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

緩沖蛋白胨水BPW(BD)；四硫磺酸鈉黃綠増菌液TTB(北京陸橋)；亞硒酸鹽胱氨酸SC(北京陸橋)；沙門菌屬顯色培養(yǎng)基(科瑪嘉)；SBG増菌液(青島海博)；陽(yáng)離子調(diào)節(jié)肉湯-CAMHB(Thermo)；2×PCR preMix(Promega)；Gel-Red(Promega)；全自動(dòng)生化鑒定儀VITEK 2(Bio-Merieux)；藥敏96孔板(Thermo)；PCR儀(Bio-RAD)；全自動(dòng)凝膠成像儀(Bio-RAD)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分離培養(yǎng)

菌種分別來自食品和腹瀉患者糞便。食品分離培養(yǎng)方法參照食品中沙門菌的分離鑒定方法GB/T 4789.4-2016；腹瀉患者樣本分離方法：挑取一定量樣本接種于SBG増菌液，36℃培養(yǎng)24 h后接種于沙門顯色培養(yǎng)基，可疑菌落進(jìn)行生化鑒定。

1.2.2 整合子分型

煮沸法提取沙門菌基因組與質(zhì)粒DNA。根據(jù)參考文獻(xiàn)[4-5]，設(shè)計(jì)I、II、III類整合子以及基因盒可變區(qū)域引物，詳細(xì)序列見表1。

表1 整合子相關(guān)基因序列Tab.1 Sequences of integron related gene

分別加入12.5 μL preMix酶預(yù)混液，8.5 μL無RNA酶水，上下游引物各1 μL，2 μL樣品DNA模板制成25 μL體系。進(jìn)行PCR反應(yīng)。整合子PCR條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，終延伸72℃ 10 min。I類整合子可變區(qū)PCR條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，56℃退貨45 s，68℃延伸6 min，30個(gè)循環(huán)；終延伸72℃ 10 min。II類整合子可變區(qū)PCR條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火55℃30 s，延伸72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)，終延伸10 min。

1.2.3 藥敏試驗(yàn)

挑取少量菌體制成1.5×108CFU/mL濃度的菌懸液，取100 μL用10mL CAMHB肉湯稀釋，稀釋后接種96孔藥敏板(15種抗菌藥物)，37℃溫育18h后，讀取最小抑菌濃度MIC值。大腸埃希菌ATCC25922作為革蘭陰性菌藥敏板質(zhì)控菌株。15種抗菌藥物包括常見的臨床上用于治療沙門菌的常用藥物見表2。

表2 149株沙門菌耐藥情況Tab.2 Drug resistance of 149 Salmonella strains

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 21.0軟件。計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示，兩組之間比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.01，若P<0.01，說明兩組數(shù)據(jù)具有顯著差異。

1.2.5 基因測(cè)序

將Var可變區(qū)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送至北京天一輝遠(yuǎn)生物公司測(cè)序。將所得基因測(cè)序序列在CARD(the comprehensive antibiotic research database)數(shù)據(jù)庫(kù)(https:// arpcard.mcmaster.ca)進(jìn)行BLAST序列分析。

2 結(jié)果

2.1 沙門菌分離

按上述方法共分離149株沙門菌，其中食源性沙門菌80株，病源性沙門菌69株。

2.2 整合子分型

以煮沸法提取的沙門菌DNA為模板，對(duì)3種整合子基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，I類整合子陽(yáng)性率33.6%(50/149)，未檢出II、III類整合子。將I類整合子陽(yáng)性的50株沙門菌進(jìn)一步檢測(cè)，對(duì)其可變區(qū)var基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。圖1為Var基因部分?jǐn)U增圖譜，其中泳道1、5、6在1500bp左右有擴(kuò)增，2泳道在1700bp左右有擴(kuò)增，4泳道在1800bp左右有擴(kuò)增，7泳道為150bp左右的空基因盒，3、8兩個(gè)泳道整合子中未攜帶基因盒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有28株菌檢測(cè)出PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物分4類，擴(kuò)增片段從150～1800bp。其中有3株P(guān)CR產(chǎn)物為150bp左右的空基因盒(整合子未捕獲任何基因)，其余25株均有1000bp以上PCR產(chǎn)物。綜合凝膠圖譜發(fā)現(xiàn)其中22株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物在約1500bp處，2株在1700bp處，1株在1800bp處，部分凝膠圖譜如圖1所示。

2.3 耐藥比對(duì)結(jié)果

將149株沙門菌按照是否攜帶整合子進(jìn)行分類，分別計(jì)算其耐藥率，比對(duì)整合子的攜帶對(duì)細(xì)菌耐藥率的影響，見表2。

表2數(shù)據(jù)分析，除亞胺培南和頭孢西丁耐藥率為0以外，其余12種抗菌藥物均有不同程度耐藥。5種耐藥率高于30%，分別為第一、二代β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物—氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑林；其余3種分別為第一代喹諾酮類抗菌藥物—萘啶酸，四環(huán)素和多黏菌素B。第三代β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物頭孢他啶和頭孢噻肟耐藥率亦高達(dá)8.1%和15.4%。耐3類及以上抗菌藥物的為多重耐藥菌株，多重耐藥菌株共75株，多重耐藥率高達(dá)50.3%。根據(jù)整合子攜帶不同，將沙門菌分成兩類。整合子陽(yáng)性與陰性菌的多重耐藥率詳見表3。將兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P=0說明沙門菌的多重耐藥性與其攜帶整合子情況相關(guān)。

表3 整合子與多重耐藥率的關(guān)系Tab.3 The relationship between integron and multidrug resistance

2.4 基因測(cè)序

由于對(duì)整合子可變區(qū)擴(kuò)增中，相同堿基數(shù)PCR產(chǎn)物比較集中，故從25個(gè)PCR產(chǎn)物中挑選10份進(jìn)行測(cè)序，其中1500bp左右PCR產(chǎn)物8份，1700和1800bp左右產(chǎn)物各一份，所得核酸序列結(jié)果進(jìn)入CARD抗菌藥物抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)。1500bp產(chǎn)物攜帶基因盒為dfrA17-aadA5；1700bp攜帶基因盒為dfrA12-aadA2；1800bp攜帶基因盒為linG，圖2為1800bp所測(cè)得的基因序列圖譜片段。

3 討論

149株沙門菌中未發(fā)現(xiàn)第II類、第III類整合子，檢出第I類整合子的菌株50株，I類整合子陽(yáng)性率為33.6%。與其他食源性致病菌相比，沙門菌整合子檢出率低于大腸埃希菌而高于副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和志賀菌等其他食源性致病菌，不同細(xì)菌耐藥性的高低與整合子檢出率趨于一致[6-7]。

在沙門菌的耐藥性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)多達(dá)12種的抗菌藥物存在耐藥性，其中總耐藥率高于50%的有3種，分別是第一代β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物氨芐西林、第一代喹諾酮類抗菌藥物萘啶酸和多黏菌素B，沙門菌對(duì)這3種抗菌藥物表現(xiàn)強(qiáng)耐藥性。沙門菌僅對(duì)頭霉素類抗菌藥物頭孢西丁以及碳青霉烯類抗菌藥物亞胺培南保持著高敏感率。對(duì)12種抗菌藥物整合子攜帶情況與沙門菌耐藥性分析得出，整合子陽(yáng)性菌耐藥率均高于整合子陰性菌1～4倍，這表明整合子的攜帶率與耐藥率存在正相關(guān)。12種抗菌藥物中有9種具有顯著差異(P<0.01)，包括β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢唑林，磺胺類抗菌藥物—磺胺甲惡唑/甲氧芐啶，喹諾酮類抗菌藥物鹽酸環(huán)丙沙星，氨基糖苷類抗菌藥物慶大霉素，大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物阿奇霉素以及四環(huán)素和氯霉素。整合子陽(yáng)性的多重耐藥率為100%，遠(yuǎn)高于整合子陰性多重耐藥率25.3%，這進(jìn)一步表明整合子對(duì)于沙門菌的多重耐藥性亦起著關(guān)鍵作用。另外，整合子陽(yáng)性的菌株在PCR擴(kuò)增時(shí)，并未檢出可變區(qū)，可能由于攜帶基因盒片段過長(zhǎng)、內(nèi)部基因盒結(jié)構(gòu)復(fù)雜，無法使用傳統(tǒng)PCR方法檢測(cè)、少數(shù)整合子缺少3'保守區(qū)等因素相關(guān)[8]。

沙門菌整合子中攜帶的耐藥基因盒大多數(shù)為磺胺類耐藥基因二氫葉酸還原酶基因dfr和氨基糖苷類耐藥基因核苷轉(zhuǎn)移酶基因aad，且兩種基因同時(shí)出現(xiàn)。由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，不攜帶此類基因盒的菌株對(duì)復(fù)方磺胺和慶大霉素的耐藥率均為0，而攜帶dfr和aad基因的菌株的耐藥率分別高達(dá)76%和50%，耐藥表型和耐藥基因結(jié)果相一致。在自然環(huán)境演變過程中，整合子攜帶率通常為3.6%，且捕獲外來基因盒的頻率僅為10-5～10-6[9-10],本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)沙門菌的I類整合子攜帶率高達(dá)33.6%，而整合子中耐藥基因盒的攜帶率為50%，這可能是由于抗菌藥物長(zhǎng)期大量使用誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌株，增大了選擇壓力，使整合子的發(fā)生率以及捕獲外來耐藥基因盒的能力均大大提高，并且在外界環(huán)境壓力下，整合子穩(wěn)定傳播，從而造成整合子及耐藥基因盒的攜帶率明顯偏高。

此外實(shí)驗(yàn)中還檢出了罕見的林可胺類耐藥基因盒l(wèi)inG，該基因盒在沙門菌整合子中鮮有報(bào)道。林可胺類抗菌藥物耐藥基因linG是于2006年首次發(fā)現(xiàn)并命名[11]，該類抗菌藥物主要作用于治療由革蘭陽(yáng)性菌帶來的人及動(dòng)物的感染性疾病，對(duì)沙門菌這種革蘭陰性腸道菌并不適用。而且在NCBI序列BLAST比對(duì)中，也僅在大腸埃希菌質(zhì)粒中檢出過該基因盒。對(duì)于此次在沙門菌中檢出的林可胺類耐藥基因盒l(wèi)inG可能是通過可移動(dòng)元件由其他細(xì)菌水平傳遞給沙門菌。盡管這種抗性基因?qū)κ荏w菌本身生存并無影響，但仍可以作為媒介傳遞給其他菌，造成耐藥性的傳播，因此沙門菌中檢出林可胺類耐藥基因盒l(wèi)inG應(yīng)該引起人們的重視。

總之，整合子的調(diào)控與表達(dá)受到多方面因素的影響，特別是沙門菌這種多年持續(xù)高耐藥率，可引起人畜共患病的致病菌更應(yīng)予以足夠重視，加強(qiáng)抗菌藥物的用藥有重要意義。就目前監(jiān)測(cè)的來源于食品和病患的沙門菌耐藥性情況看，本地區(qū)沙門菌的I類整合子攜帶率較高，對(duì)多種抗菌藥物均具有明顯的耐藥性，整合子的攜帶率與耐藥性存在高度相關(guān)性。整合子的陽(yáng)性攜帶率與沙門菌的多重耐藥亦密切相關(guān)。整合子所攜帶的耐藥基因主要為dfr和aad，耐藥表型和耐藥基因結(jié)果相一致。此外，罕見的林可胺類耐藥基因盒l(wèi)inG首次在沙門菌中被發(fā)現(xiàn)，盡管目前該基因盒對(duì)沙門菌抗菌藥物的耐藥性影響不大，但鑒于整合子作為可移動(dòng)元件傳遞耐藥基因，亦需引起人們的重視。