B淋巴細(xì)胞功能變化在不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)中的作用研究

譚宗建 耿婷 劉人杰 鄔衛(wèi)東

(1.貴州省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，貴州 貴陽 550002；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002)

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent pregnancy loss，RPL)患者中以早期流產(chǎn)多見，嚴(yán)重威脅胚胎的正常著床發(fā)育及母體的健康。相關(guān)文獻(xiàn)[1]表明，RPL發(fā)病率約3%～5%，除染色體異常、解剖因素、內(nèi)分泌因素、生殖道感染、血栓前狀態(tài)等明確的病因外，仍有約60%患者原因不清，即不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(unexplained recurrent pregnancy loss，URPL)。目前認(rèn)為，大部分URPL與免疫因素有關(guān)。生殖免疫學(xué)認(rèn)為胚胎對(duì)于母體來說類似同種半異己的移植物，成功的妊娠有賴于母胎免疫耐受的建立與維持，自然流產(chǎn)則是免疫耐受的終止。目前專家學(xué)者們提出了Th1/Th2平衡學(xué)說來解釋此種情況。且研究[2]證實(shí)封閉抗體陰性患者經(jīng)過配偶淋巴細(xì)胞免疫治療后患者在孕期體內(nèi)的Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子呈活躍狀態(tài)，參與維持正常妊娠狀態(tài)。有研究[3]對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)患者進(jìn)行證實(shí)，其外周血中B淋巴細(xì)胞增殖功能及分泌功能均較健康女性外周血中B淋巴細(xì)胞功能增強(qiáng)，提示B細(xì)胞淋巴細(xì)胞可能在該疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用，而在孕期其病情則會(huì)有加重趨勢(shì)，以上均提示Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子所介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)在正常妊娠時(shí)起著不可替代的重要作用。Th2細(xì)胞分泌一系列細(xì)胞因子介導(dǎo)體內(nèi)的體液免疫。因此可以認(rèn)為，母體的體液免疫增強(qiáng)，細(xì)胞免疫抑制是維持正常妊娠免疫耐受的重要因素。但妊娠期母體增強(qiáng)的體液免疫有何意義？在誘導(dǎo)母胎免疫耐受中有何作用？近期有學(xué)者對(duì)自然流產(chǎn)后女性的胎盤組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可以產(chǎn)生糖基化的免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)并參與母胎界面的免疫耐受，對(duì)抗同種異體抗原對(duì)胎兒和胎盤產(chǎn)生的免疫作用；相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)了這一理論[4]。這一研究成果揭示了免疫逃逸的相關(guān)機(jī)制，并為妊娠生理學(xué)和免疫學(xué)的進(jìn)一步研究打開了一個(gè)新的維度。本研究擬通過檢測(cè)URPL患者外周血B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能變化及B淋巴細(xì)胞增殖功能的變化，以不孕患者和自身抗體譜陽性的URPL患者作為對(duì)照，初步探討母體B淋巴細(xì)胞功能變化在URPL發(fā)病過程中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2016年3—10月在貴州省人民醫(yī)院生殖中心就診的復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者。所有患者均通過婦科常規(guī)檢查、盆腔B超、子宮輸卵管碘油造影或?qū)m腔鏡檢查，胰島素、血糖及甲狀腺功能和自身抗體譜、凝血功能的檢查,夫妻雙方染色體核型分析及ABO血型檢測(cè)，病毒及細(xì)菌感染的檢測(cè)，抗子宮內(nèi)膜抗體、抗精子抗體的檢查等排除了因遺傳因素、解剖因素、內(nèi)分泌因素、感染因素、血液高凝狀態(tài)以及自身免疫系統(tǒng)疾病等因素所致的復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)。根據(jù)病史及生殖中心流產(chǎn)原因篩查結(jié)果對(duì)患者進(jìn)行分組。A組(RPL合并早期妊娠患者)：為在我院門診就診的滿足復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)診斷的患者，經(jīng)相關(guān)檢查及相應(yīng)治療后，現(xiàn)已妊娠，hcG升高，B超可見孕囊及原始心管搏動(dòng)，孕周≤12周者。B組(自身抗體陽性的RPL患者)：為在我科門診就診，滿足復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)，完善相關(guān)檢查排除了因遺傳因素、解剖因素、內(nèi)分泌因素、感染因素以及血液高凝狀態(tài)等致病因素，而自身抗體為陽性的復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者。C組(自身抗體陰性、封閉抗體陰性的RPL患者)：為在我科門診就診，滿足復(fù)發(fā)性早期自然流產(chǎn)疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)，完善相關(guān)檢查排除了因遺傳因素、解剖因素、內(nèi)分泌因素、感染因素以及自身抗體等因素所致而封閉抗體為陰性的復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者。D組(不孕患者)：收集同期來自生殖中心門診行不孕檢查的患者，經(jīng)相應(yīng)檢查排除了自身抗體陽性、甲狀腺功能異常者，納入此組作為對(duì)照組。每位受試者建立詳細(xì)病歷資料，并充分知情同意。已排除染色體異常，風(fēng)濕、類風(fēng)濕、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫疾病、心血管疾病、肝臟疾病、腎臟疾病、惡性腫瘤等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1外周血淋巴細(xì)胞分離與培養(yǎng) 抽取患者肘靜脈血3 mL于EDTA抗凝劑采血管中，并于4 h內(nèi)處理。超凈工作臺(tái)消毒后，無菌操作，取等量PBS(北京Solarbio 公司)稀釋3 mL外周血，并輕翻轉(zhuǎn)混勻。用巴氏管吸取3 mL淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锶A科生物科技有限公司)置于15 mL離心管底部。傾斜離心管45°，將稀釋后的血液用注射器沿管壁小心緩慢加入至淋巴分離液上方，形成分離面，并保持兩者界面清晰。室溫水平將樣本離心2 000 rpm×20 min。吸取單個(gè)核細(xì)胞層(白膜層)，轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，加入PBS洗滌，并用巴氏管吹洗。室溫水平離心2 000 rpm×5 min，棄洗滌液后，再次如前洗滌，并棄洗滌液，留細(xì)胞懸液。用恢復(fù)至室溫的完全細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為7～8×105/mL。將細(xì)胞置于12孔板中培養(yǎng)，每孔加入1 mL細(xì)胞懸液培養(yǎng)。每個(gè)樣本分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組加入SPA(5 μg/mL) (北京Solarbio 公司)及IL-2(10 ng/mL)(英國(guó)Peprotech公司)；空白組未加入刺激物。置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5 d。

1.2.2B淋巴細(xì)胞增殖功能測(cè)定 培養(yǎng)后的細(xì)胞懸液用移液槍混勻，并分別取200 μL置于96孔板中，每樣本每組設(shè)置復(fù)孔3個(gè)，并于空白孔中加入完全培養(yǎng)基200 μL，設(shè)置復(fù)孔3個(gè)，作為調(diào)零組。并于每孔中加入20 μL配置好的MTT溶液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4 h后，取樣品于96孔板離心機(jī)中離心1 000 rpm×10 min。棄上清，留96孔板板底藍(lán)紫色沉淀物質(zhì)。每孔加入DMSO100 μL溶解沉淀物，并形成藍(lán)紫色液體。于酶標(biāo)儀中以中速震蕩混勻10 min，以調(diào)零組調(diào)零并檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處待測(cè)孔OD值。MTT結(jié)果以刺激指數(shù)(SI)表示，計(jì)算公式：SI值=(實(shí)驗(yàn)組D490 nm值-調(diào)零組D490 nm值)/(對(duì)照組D490 nm值-調(diào)零組D490 nm值)

1.2.3B淋巴細(xì)胞分泌功能檢測(cè) 操作按照人IgG ELISA試劑盒 (北京誠(chéng)林生物科技有限公司)說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

早孕患者及自身抗體陽性的患者其外周血B淋巴細(xì)胞經(jīng)過與SPA及IL-2的共同培養(yǎng)后，其增值效果顯著，較之其他組別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但A、B兩組之間(P=0.394)，C、D兩組之(P=0.786)間，其差別并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。自身抗體陽性的患者較之封閉抗體陰性的RPL患者，經(jīng)過絲裂原及IL-2的刺激其分泌IgG的能力增強(qiáng)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030)，而其余各組間比較其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 B淋巴細(xì)胞功能變化

3 討 論

免疫細(xì)胞T細(xì)胞在母胎的免疫耐受方面發(fā)揮著重要作用，Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞根據(jù)其分泌的細(xì)胞因子不同分而分化的兩個(gè)亞型。其不僅可以識(shí)別主要組織相容性復(fù)合物-Ⅱ(major histocompatibility complex，MHC)類分子，還可以識(shí)別抗原并激活B淋巴細(xì)胞，使后者分化為漿細(xì)胞并分泌特異性抗體，并增強(qiáng)機(jī)體體液免疫反應(yīng)。Th1細(xì)胞可分泌IL-2、IFN-γ，主要參與機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)。而Th2細(xì)胞則產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13等，抑制Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生并刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體、輔助體液免疫反應(yīng)。與正常妊娠相比，復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者Th1型細(xì)胞因子如IL-2和IFN-γ明顯升高，外周血IL-10則明顯降低[5]。說明Th1細(xì)胞及其介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)可能在RPL患者的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著一定的作用。目前國(guó)內(nèi)外研究廣泛認(rèn)為，正常妊娠期母體Th1/Th2平衡偏向Th2細(xì)胞為主的免疫反應(yīng)，并且通過一些列反應(yīng)介導(dǎo)母體體液免疫反應(yīng)增強(qiáng)，為胚胎的著床及發(fā)育提供適宜的環(huán)境，維持正常妊娠。在早孕期間母體內(nèi)眾多免疫細(xì)胞、蛻膜基質(zhì)的局部細(xì)胞因子參與母胎界面的免疫耐受，體液免疫在正常妊娠的免疫耐受中發(fā)揮著重要作用，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，B細(xì)胞有著重要的作用，其介導(dǎo)體液免疫并產(chǎn)生抗體。

本研究表明，在經(jīng)過系統(tǒng)篩查和相應(yīng)治療后，RPL患者再次妊娠時(shí)，其外周血中B淋巴細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)增殖潛能遠(yuǎn)較封閉抗體陰性的PRL患者及不孕患者強(qiáng)，該結(jié)果提示早孕時(shí)，母體內(nèi)可能通過一系列免疫反應(yīng)激發(fā)了B淋巴細(xì)胞的潛能，并可能參與后續(xù)一系列體液免疫反應(yīng)，介導(dǎo)母體對(duì)早期胚胎的免疫耐受。近來確有研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞可以產(chǎn)生IL-10，抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答從而介導(dǎo)妊娠免疫耐受[6]，表明B淋巴細(xì)胞可能在正常妊娠的免疫耐受中亦發(fā)揮著一定作用。正常妊娠母體可以激發(fā)保護(hù)胎兒免于免疫反應(yīng)的aIgG(asymmetric IgG)的產(chǎn)生。但相關(guān)研究表明自身免疫疾病患者外周血B細(xì)胞類型之間可呈現(xiàn)不平衡表達(dá)，其幼稚B細(xì)胞的表達(dá)增高，并且可以促使相關(guān)細(xì)胞因子和自身抗體的表達(dá)，對(duì)妊娠母體及胚胎產(chǎn)生不利影響，引起流產(chǎn)等不良后果[7]。在SLE患者中，外周血中漿母細(xì)胞和IgD+CD27+記憶B細(xì)胞表達(dá)增加，導(dǎo)致患者妊娠期間抗雙鏈DNA抗體滴度增高[8]，母體增強(qiáng)的免疫反應(yīng)可對(duì)胎兒產(chǎn)生不良影響。多種自身抗體可以形成免疫復(fù)合物沉積于腎臟，并引起不同程度的腎臟損害，引發(fā)腎炎。但是免疫復(fù)合物不僅可以沉積于腎臟，其也可以在胎盤局部積聚，影響正常妊娠。抗核抗體(ANA)是引起RPL的重要免疫因素，M.Veglia等[9]用人ANA-IgG處理早孕小鼠并檢測(cè)其胎盤補(bǔ)體和免疫復(fù)合物沉積情況，結(jié)果表明經(jīng)處理的小鼠胎盤組織上免疫復(fù)合物增加、補(bǔ)體表達(dá)上調(diào)，并且流產(chǎn)率較高。這些研究表明體內(nèi)過度激活的體液免疫反應(yīng)，促使B淋巴細(xì)胞分泌大量的IgG，在體內(nèi)與抗原發(fā)生反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，并誘使免疫復(fù)合物積聚于胎盤、激活補(bǔ)體系統(tǒng)導(dǎo)致母體對(duì)導(dǎo)胎兒的免疫不耐受，從而引起了流產(chǎn)。我們的研究結(jié)果表明，自身抗體陽性的RPL患者外周血中淋巴細(xì)胞增殖潛能(P<0.01)高于對(duì)照組不孕女性；而與封閉抗體陰性的患者相比，其淋巴細(xì)胞不僅增殖潛能(P<0.01)增強(qiáng)，其分泌IgG的能力也顯著提高(P=0.030，P<0.05)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示自身抗體陽性的患者其體液免疫系統(tǒng)可能被過度激活，與體內(nèi)的抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，通過復(fù)雜的機(jī)制，誘導(dǎo)母體內(nèi)一些列免疫反應(yīng)，對(duì)同種異體移植物—胚胎產(chǎn)生了排斥作用，導(dǎo)致早期自然流產(chǎn)。

國(guó)外有研究[10]表明，患體液免疫缺陷疾病的女性其不孕癥及自然流產(chǎn)發(fā)生率均較正常女性提高。另有個(gè)案報(bào)道稱RPL患者外周血中CD19+B細(xì)胞增加，而記憶B細(xì)胞則減少，給予糖皮質(zhì)激素及免疫球蛋白治療后，患者成功妊娠，且其孕期類型轉(zhuǎn)換的記憶B細(xì)胞(switched memory B cells CD27+IgD61)明顯增加，并伴CD19+B細(xì)胞、初始B細(xì)胞的減少[11]。對(duì)URPL患者的研究表明其外周血中CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞及B-1細(xì)胞比例顯著增高，CD20+B細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞比例低于正常女性，但其子宮內(nèi)膜局部T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞等白細(xì)胞的表達(dá)并無差異[12]。但患者經(jīng)過靜脈注射免疫球蛋白治療后，在早孕期CD19+B細(xì)胞的比例增加。這表明在經(jīng)過免疫治療的URPL患者中，體液免疫系統(tǒng)似乎被激活，參與維持正常妊娠耐受。另有研究采用培養(yǎng)正常早孕蛻膜細(xì)胞的上清液與外周血B淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，可以促進(jìn)IgG的分泌；而這種作用可被外源性細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-6等)增強(qiáng)[13]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦表明[14]在孕早期，B淋巴細(xì)胞被激活，其轉(zhuǎn)化值呈上升趨勢(shì)，T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化值則維持較低的水平，而在正常妊娠晚期及分娩日，其外周血中B細(xì)胞的表達(dá)則低于未妊娠女性。這均表明在早孕期間，母體內(nèi)可通過一系列生物反應(yīng)，一定程度上激活體液免疫系統(tǒng)，B淋巴細(xì)胞活性增高，使得體液免疫增強(qiáng)，并在維持正常妊娠中發(fā)揮著舉足輕重的作用。我們的研究表明曾有RPL病史的患者妊娠后，其外周血中B淋巴細(xì)胞增殖的潛能較封閉抗體陰性的患者及不孕女性提高，但對(duì)其在體外培養(yǎng)的過程產(chǎn)生的IgG進(jìn)行檢測(cè)并未發(fā)現(xiàn)其與自身抗體陽性RPL患者(P=0.176)、封閉抗體陰性患者(P=0.483)及正常未孕女性(P=0.752)外周血中細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)所分泌的IgG并無明顯差異。

近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)進(jìn)行了深入的研究認(rèn)為異常的免疫調(diào)節(jié)是引起疾病的重要原因。有RPL病史的患者妊娠后，其外周血中B淋巴細(xì)胞增殖的潛能較封閉抗體陰性的患者及正常未孕女性提高。而封閉抗體陰性的患者，其外周血中B淋巴細(xì)胞在相同的刺激下，細(xì)胞增殖水平低于早孕及自身抗體陽性的PRL患者。研究提示母體內(nèi)的體液免疫調(diào)節(jié)失衡可能是不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的一個(gè)重要因素。不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)是多因素作用的結(jié)果，對(duì)病因分析應(yīng)從多方面著手，拓寬思路，尋找更好的治療方法，為解決復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)這一難題開辟一條行之有效的途徑。