LncRNA XIST通過miR-193a-3p/RSF1軸對骨肉瘤細胞增殖和遷移的作用研究*

孔德海，馮德香，劉峻滔，鄧明明，付炳金，尹 剛，朱曉東

(1.濱州醫學院附屬醫院足踝外科，山東濱州 256600；2.濱州醫學院附屬醫院腫瘤科，山東濱州 256600；3.濱州醫學院煙臺附屬醫院創傷骨科，山東濱州 256600)

骨肉瘤是從間質細胞系發展而來的一種惡性成骨性腫瘤，常發于青少年[1]。骨肉瘤可導致肌肉萎縮、骨折，影響運動系統、呼吸系統等功能，威脅患者生命安全。目前我國在骨肉瘤治療方面取得了一定的進展，但由于骨肉瘤患者易發生早期肺轉移，復發率高，因此整體治療效果較差[2]。骨肉瘤靶向基因治療一直是基礎研究的熱點，但目前仍無精確的靶向藥物應用于臨床，因此探究有效抑制骨肉瘤細胞增殖和遷移的基因，為骨肉瘤的治療提供新的靶點尤為重要。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類轉錄本超過200 nt，不編碼蛋白的RNA分子，它能夠在多種層面上調控基因的表達[3]。miR-193a-3p和重構剪切因子1(RSF1)是與腫瘤發生、發展相關的基因，參與細胞的多種生物學功能，且RSF1被認為是miR-193a-3p直接作用靶點，miR-193a-3p能通過抑制RSF1基因表達，調控腫瘤細胞的生物學進程[4]。研究證實，lncRNA X染色體失活特異轉錄本(X chromosome inactivation specific transcripts，XIST)能促進腫瘤的發生、發展，lncRNA XIST在多數腫瘤中上調，并促進腫瘤向遠處轉移[5]。目前雖有研究發現降低lncRNA XIST可抑制骨肉瘤細胞增殖和遷移，但miR-193a-3p/RSF1軸對骨肉瘤細胞的作用研究較少[6]。因此，本文研究lncRNA XIST通過miR-193a-3p/RSF1軸對骨肉瘤細胞增殖和遷移的作用，為找到治療骨肉瘤的精確靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標本和細胞株

收集2017年9月至2018年12月濱州醫學院煙臺附屬醫院30例骨肉瘤切除手術中的癌組織和癌旁組織，液氮中保存。收集病例標準：(1)符合骨肉瘤診斷標準，并經細胞系或病理學確診的骨肉瘤；(2)未經任何抗腫瘤治療；(3)經醫院倫理委員會審查批準，并征得患者同意，簽署知情同意書。人骨肉瘤細胞株HOS購自上海塞默生物科技發展有限公司。

1.1.2主要試劑和儀器

空載質粒、sh-lncRNA XIST重組質粒、miR-193a-3p mimic/inhibitor購自上海吉瑪制藥技術有限公司；DMEM培養基、10%的胎牛血清(FBS)購自鄭州九龍生物制品有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自上海篤瑪生物科技有限公司；兔抗人RSF1(一抗)、山羊抗兔RSF1(二抗)購自美國CST公司；CCK-8試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒、TRIzol試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE制備試劑盒購自北京智杰方遠科技有限公司；DYY-4C電泳儀購自上海巴玖實業有限公司；GE凝膠成像儀購自蘇州艾比拓生物技術有限公司；RJ17DG5033A型酶聯免疫檢測儀購自南京華東電子醫療設備有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1RT-qPCR檢測骨肉瘤組織及癌旁組織中lncRNA XIST mRNA表達

骨肉瘤組織和旁癌組織中的總RNA提取采用TRIzol試劑盒，反轉錄成cDNA模板，參照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書進行RT-qPCR，lncRNA XIST引物序列見表1。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性40 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35次循環。采用β-actin作為內參，2-△△CT法計算lncRNA XIST的相對表達量。

1.2.2細胞培養、轉染及分組

將骨肉瘤細胞株HOS培養于含10% FBS、100 μ/mL青霉素、100 μ/mL鏈霉素的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。轉染前1 d，將HOS細胞接種到6孔板中，分為3組，分別是空白組、空載組和實驗組，每組設5個復孔?？瞻捉MHOS細胞不做任何處理，空載組和實驗組按Lipofectamine 2000轉染試劑說明書將空載質粒和sh-lncRNA XIST重組質粒分別轉染至HOS細胞，繼續培養48 h后，熒光顯微鏡檢測細胞轉染效率，轉染效率大于80%進行后續實驗。

勵志教育是我國高等教育的重要組成部分，不論是在思想觀念層面還是實踐層面，高校教育工作者都要以各具個性、富有特色的方式靈活開展勵志教育，對大學生的當下處境和現實使命進行清晰解讀和前瞻性引領，讓大學生最大限度地發揮自身潛能。具體而言，大學勵志教育對學生能起到思想信念指引、育人文化涵養和學業目標導向等功能。

1.2.3CCK-8法檢測細胞增殖能力

取對數期生長的各組細胞，接種于96孔板，調整細胞濃度為1×106/mL，將培養板放入37 ℃、5% CO2的培養箱內，觀察培養24、48、72 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續培養4 h，酶聯免疫檢測儀測量各孔在450 nm處的吸光度(A)值。

1.2.4劃痕實驗檢測細胞遷移能力

取對數期生長的各組細胞，接種到6孔板內，調整細胞密度為5×103/mL，待細胞鋪滿后，用10 μL無菌槍頭在孔板上均勻劃線，PBS洗去劃下的細胞，不含血清的培養基中培養24 h。倒置顯微鏡拍攝0、24 h時細胞遷移狀態，Image圖像分析計算細胞融合距離，細胞融合距離=初始劃痕寬度-終末劃痕寬度。

1.2.5雙熒光素酶報告基因實驗檢測lncRAN XIST、miR-193a-3p與RSF1之間的作用關系

將miR-193a-3p mimic/inhibitor分別與LncRNA XIST Wt/Mut共轉染，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養8 h，換0.5 mL含10% FBS且不含維生素的正常DMEM培養基，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h，收集細胞。再將miR-193a-3p mimic/inhibitor分別與RSF1 Wt/Mut共轉染細胞，操作同上。應用雙熒光素酶報告基因實驗檢測熒光素酶，酶標儀檢測螢火蟲熒光素光吸收值、海腎熒光素光吸收值，以海腎熒光素光值為內參，熒光素酶活性=螢火蟲熒光素光吸收值/海腎熒光素光吸收值。

1.2.6RT-qPCR檢測細胞lncRNA XIST、miR-193a-3p、RSF1 mRNA表達

取穩定轉染48 h各組細胞，參照TRIzol試劑盒說明書，提取HOS細胞中的總RNA，逆轉錄獲取cDNA模版，參照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書設定反應體系，引物序列見表1。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35次循環。miR-193a-3p采用U6作為內參，lncRNA XIST和RSF1采用β-actin作為內參，2-△△CT法計算lncRNA XIST、miR-193a-3p、RSF1的相對表達量。

表1 相關基因擴增引物序列

1.2.7Western blot檢測RSF1蛋白表達

取穩定轉染48 h各組細胞，RIPA裂解液提取細胞總蛋白，蛋白濃度用BCA試劑盒檢測，SDS-PAGE電泳分離蛋白，電轉法將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入按1∶1 000的一抗，4 ℃培養過夜，TBST溶液清洗3次，加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，TBST再清洗3次，加入ECL反應液，凝膠成像系統采集圖像并觀察分析。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 癌組織與癌旁組織中lncRNA XIST mRNA表達

癌組織中lncRNA XIST mRNA表達(6.27±1.88)明顯高于癌旁組織(3.15±0.41)，差異有統計學意義(t=8.881，P<0.05)。

2.2 各組細胞A值

與空白組和空載組比較，培養24、48、72 h時，實驗組的A值明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。不同時點空白組和空載組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。各組隨著干預時間的延長A值升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組細胞不同時點A值比較

2.3 各組細胞融合距離

空白組、空載組、實驗組細胞融合距離分別為(87.9±22)μm、(85.7±17)μm、(43.5±11)μm，組間比較，差異有統計學意義(F=10.506，P=0.002)。與空白組和空載組比較，實驗組24 h時細胞融合距離明顯縮短，差異有統計學意義(t=4.036，P=0.004；t=4.660，P=0.002)，而空白組和空載組比較，差異無統計學意義(t=0.177，P=0.864)，見圖1。

圖1 各組細胞遷移情況(×100)

2.4 熒光素酶報告基因實驗結果

lncRAN XIST與miR-193a-3p存在互補序列，過表達miR-193a-3p可明顯抑制lncRAN XIST-Wt的熒光素酶活性(P<0.05)，對lncRAN XIST-Mut熒光素酶活性無抑制作用，見圖2、3。miR-193a-3p能結合RSF1的3′UTR區域，二者結合序列與lncRAN XIST、miR-193a-3p結合序列部分相同，過表達miR-193a-3p可明顯抑制RSF1-Wt熒光素酶活性(P<0.05)，見圖4、5。

圖2 生物信息學數據庫Starbase預測結果

*：P<0.05。圖3 lncRAN XIST、miR-193a-3p靶向作用關系

圖4 生物信息學數據庫TargetScan分析結果

*：P<0.05。圖5 miR-193a-3p、RSF1的靶向作用關系

2.5 各組細胞lncRNA XIST、miR-193a-3p、RSF1 mRNA表達

與空白組和空載組比較，實驗組lncRNA XIST、RSF1 mRNA表達明顯降低，miR-193a-3p mRNA表達明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，而空白組和空載組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組lncRNA XIST、miR-193a-3p、RSF1 mRNA表達

2.6 各組細胞RSF1蛋白表達

空白組、空載組和實驗組的RSF1蛋白表達分別為1.12±0.22、1.08±0.17、0.56±0.07，差異有統計學意義(F=24.988，P<0.001)。與空白組和空載組比較，實驗組RSF1蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義(t=6.392，P<0.001；t=7.541，P<0.001)?？瞻捉M和空載組比較，差異無統計學意義(t=0.322，P=0.756)，見圖6。

圖6 各組細胞RSF1蛋白表達情況

3 討 論

骨肉瘤是骨科常見的惡性腫瘤，起源于骨骼系統的結締組織，好發部位是股骨遠端和脛骨后端。據相關統計，在原發性惡性腫瘤中骨肉瘤是發病率較高的一種，占青少年和兒童骨癌的56%[7-8]。骨肉瘤目前的治療手段包括手術治療、化療和保肢重建手術等多種方式相結合，隨著治療水平的不斷提高，骨肉瘤患者5年生存率明顯提高[9]。然而，當前的治療手段也存在不少弊端，例如化療藥物會對正常組織產生毒性，導致患者出現貧血、心臟損傷等不良反應，故尋找有效治療骨肉瘤的方法迫在眉睫。近年來，基因治療、分子靶向治療在骨肉瘤治療研究中取得了較大進展，有研究發現lncRNA XIST對癌細胞增殖和遷移有較大影響[10]。因此，研究lncRNA XIST對骨肉瘤細胞的調控機制，對治療骨肉瘤有重要意義。

lncRNA是一類非蛋白編碼轉錄本，大多數lncRNA調控腫瘤發展進程是通過抑制或促進miRNA表達來影響癌細胞的惡性生物學行為，lncRNA可以結合并抑制miRNA活性，降低其對下游基因干擾，從而促進下游基因mRNA翻譯，被研究證實在各種生物調控中起重要作用，且與人類的多種疾病相關[11-12]。lncRNA XIST是XIST基因上游非編碼區調節因子，在細胞增殖、分化方面起關鍵作用。GAO等[13]研究發現，敲降lncRNA XIST可抑制骨肉瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡。XU等[14]發現敲降lncRNA XIST后，lncRNA XIST能與EZH2結合，下調P21的表達，進而抑制骨肉瘤細胞的增殖、阻滯細胞周期。本研究發現，lncRNA XIST在骨肉瘤細胞中高表達，敲降lncRNA XIST后CCK-8試驗顯示A值降低，24 h融合距離縮短，說明敲降lncRNA XIST能明顯抑制癌細胞增殖和遷移能力。

研究表明，miR-193a-3p的異常表達與多種腫瘤發生、發展有關，在胰腺癌中miR-193a-3p通過靶向CCND1基因抑制癌細胞增長，可能具有抑制癌基因的作用[15]。lncRNA可以充當miRNA的前體來調節mRNA的穩定性，在腫瘤的診療中具有重大潛力。隨著對lncRNA研究的深入，ZHUANG等[16]發現，lncRNA XIST可通過靶向miR-92抑制肝癌細胞的增殖和遷移，揭示lncRNA XIST/miR-92b/Smad7信號軸能調控肝癌的發展進程。另有研究顯示，lncRNA XIST/miR-124/AR信號軸在膀胱癌的細胞增殖、遷移中發揮重要作用[17]。RSF1通過調節染色體結構參與多種細胞轉錄、復制過程，WU等[18]研究發現，RSF1在骨肉瘤細胞中高度表達，且與miR-193a-3p呈負相關，RSF1被證實是miR-193a-3p的直接靶點，lncRNA XIST可以抑制miR-193a-3p，調節其下游基因RSF1。本研究結果顯示，敲降lncRNA XIST，lncRNA XIST、RSFI mRNA表達降低，miR-193a-3p mRNA表達升高，RSFI蛋白表達降低。本研究結合雙熒光素酶報告基因實驗、RT-qPCR實驗發現，lncRNA XIST、miR-193a-3p與RSF1之間存在靶向關系。

綜上所述，敲降lncRNA XIST能抑制骨肉瘤細胞增殖和遷移能力，可能是通過上調miR-193a-3p mRNA表達，下調RSFI mRNA和蛋白表達發揮作用。下一步應研究敲降lncRNA XIST是否存在其他調控機制來抑制骨肉瘤細胞增殖和遷移，為臨床治療骨肉瘤提供參考。