東魁楊梅種仁油提取工藝及抗氧化活性研究

陳俊宇，孔偉華，黃 怡，吳成茹，崔 琦，劉巨釗

(浙江中醫藥大學藥學院1，杭州 311402)(浙江中醫藥大學基礎醫學院2，杭州 310053)(浙江中醫藥大學生命科學學院3，杭州 310053)

楊梅(Myricarubra)是楊梅科楊梅屬植物，分布于我國南部各省，生于低山丘陵向陽山坡或山谷中，至今已有上千年的栽培歷史[1,2]。作為重要的藥食同源植物，楊梅的根、樹皮、果實均可入藥，其藥用價值最早記載于唐代孟詵編纂的《食療本草》中，《本草綱目》中記載其果實可入藥，其味甘酸，性溫，可用于治療扁桃體炎、牙齦紅腫等疾病[3,4]。我國是全世界最大的楊梅產區，浙江省仙居市的楊梅品質最佳[5]。楊梅除了作為水果以外，還在飲料、罐頭等食品加工行業占有一席之地，楊梅種仁富含植物油脂、蛋白質、維生素等營養成分[6,7]。目前國內外對楊梅種仁油的研究尚處起步階段，尤其是對東魁楊梅種仁的相關研究尚且較少。油脂是人類日常攝入的物質之一，具有抗氧化功能。相比于過多攝入會引發膽固醇與血糖迅速上升的飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸的適量攝入更具優勢，如阻礙脂肪團、改善血脂以及血糖的整體水平、防控突然發生心血管病的隱患，還有助于促進糖尿病的迅速康復[8,9]。

中藥提取是影響因素復雜的非線性過程。響應面法(RSM)是提取工藝優化的傳統方法，但存在無法反映多因素多水平的非線性復雜關系的局限性，且依賴于大量的驗證實驗[10]。人工神經網絡(ANN)基于其輸入層、隱藏層、輸出層的3層神經網絡結構，可通過相應函數完成輸入層與輸出層的高度非線性擬合，從而實現對多因素多指標的實驗優化，因此在提取工藝的優化中具有更大的優勢[11]。目前ANN已經在提取工藝優化中得到了一定的應用，如生物堿、皂苷、黃酮等活性成分的提取工藝優化[12]。ANN在油脂的高效提取中應用效果較好，如應用超臨界CO2流體提取枸杞籽中棕櫚酸、亞油酸等物質，經過ANN的工藝優化，提取率14.28%，可達原料含脂量的91%[13]。本實驗研究了東魁楊梅的種仁油的提取工藝及抗氧化活性，以期提高楊梅資源利用率，尋找并開發油料植物的替代資源，為油脂資源開發提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

東魁楊梅(Myricarubracv.Dongkui, MRDK)于2021-06采自浙江省臺州市橫溪鎮(120.470 6 °E, 28.735 2 °N)，并由浙江中醫藥大學張春椿副教授鑒定。提取所用試劑為分析純，檢測所用試劑為色譜純。

1.2 提取及工藝優化

1.2.1 索氏提取

稱量5.0 g粉碎后的東魁楊梅種仁，放入索氏提取器中，并加入100 mL石油醚(60～90 ℃)，在80 ℃下水浴中提取6 h。經毛細管法檢測無油脂后，完成提取，并經減壓濃縮后得到東魁楊梅種仁油(MRDK kernel oil, MRDKKO)，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 超聲有機溶劑提取

準確稱量5.0 g粉碎后的東魁楊梅種仁，置于錐形瓶中，并加入石油醚(60～90 ℃)，在超聲輔助提取儀中進行提取，在提取過程中分別對液固比、提取時間、提取溫度、超聲功率進行單因素考察，再利用人工神經網絡對提取工藝進行進一步優化。提取結束后，進行抽濾，并經減壓濃縮后得到東魁楊梅種仁油，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3 脂肪酸成分分析

1.3.1 脂肪酸轉酯化

準確稱量5.0 g的MRDKKO于圓底燒瓶中，依次加入45 mL甲醇和5 mL的H2SO4甲醇溶液(0.1 mol/L)，放入轉子后連接好反應裝置，于300 r/min轉速下，在80 ℃水浴中，進行脂肪酸轉酯化，反應時間為2 h。反應結束后將冷卻至室溫的燒瓶中溶液全部轉移至分液漏斗中后，加入適量去離子水，靜置4 h。上層即為脂肪酸甲酯，加入適量無水Na2SO4后，按1∶1 000加入色譜正己烷，以14 000 r/min離心后置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 GC/Q-TOF MS檢測

安捷倫7890B-7250四級桿飛行時間質譜儀(GC/Q-TOF MS)。色譜條件：色譜柱：HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；升溫程序為：初始溫度50 ℃，以60 ℃/min升溫至170 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升溫至180 ℃，保持5 min，最后以20 ℃/min升溫至220 ℃，保持5 min；載氣為高純氦氣(99.999 9%)，流速1.2 mL/min；進樣量1 μL；不分流。質譜條件：電子轟擊電離(EI)模式，電離能源70 eV，離子源溫度200 ℃，傳輸線溫度290 ℃，數據采集方式為TOF-Scan全掃描；質量掃描范圍m/z50～500；采集速率5 spectra/s；溶劑延遲5 min。通過NIST14標準譜數據庫并結合文獻資料完成結構鑒定。

1.4 理化性質測定

相對密度：GB/T 5518—2008，折射系數：GB/T 5527—2010，酸值：GB/T 5530—2005，碘值：GB/T 5532—2008，過氧化值：GB/T 5538—2005。

1.5 SEM分析

將提取前后的東魁楊梅種仁置于真空干燥箱中烘干至恒重，制樣后，經噴金處理，于SU8010場發射掃描電子顯微鏡下進行觀察分析。

1.6 DPPH自由基清除活性

分別將0.1 mL一系列濃度的東魁楊梅種仁油與1.4 mL 95%乙醇及1 mL 40 μg/mL的DPPH乙醇溶液進行混合，避光放置70 min后于517 nm波長下測定其吸光度，空白樣品以95%乙醇替代樣品溶液，實驗重復3次，且VC為對照。

1.7 統計分析

所有實驗均重復3次，使用MS Excel完成統計分析，用Origin 8.0軟件作圖，使用MATLAB完成人工神經網絡代碼編寫及相關優化。

2 結果與分析

2.1 油脂成分

索氏提取法對MRDKKO的得率為62.00%。轉酯化后通過GC/Q-TOF MS結果可以看出(圖1)，共有5個主要的信號峰，其中含量最高的2個信號峰分別是亞油酸和油酸，總不飽和脂肪酸質量分數高達82.20%，其種類及對應關系如表1所示。

注：圖中編號與表1對應一致。

與荸薺楊梅種仁油相比(表2)，MRDKKO酸值、過氧化值均較低，結合表1不難發現，這是由于MRDKKO中游離脂肪酸更少、不飽和脂肪酸含量更高造成的。與傳統食用油大豆油和橄欖油相比，MRDKKO酸值及過氧化值顯著低于大豆油和橄欖油[14,15]，碘值則介于大豆油與橄欖油之間，表明MRDKKO已達到食用油的標準，可作為天然食用油進行開發。

表1 東魁楊梅種仁油的脂肪酸成分

表2 東魁楊梅種仁油主要理化性質

2.2 單因素及人工神經網絡實驗

2.2.1 單因素實驗

在圖2中，MRDKKO的提取率隨液固比的增加而顯著增加，而當液固比達到14 mL/g時，MRDKKO的提取率基本不再增加，這是因為液固比為12 mL/g時提取率已基本達到最大值，使用過多的提取溶劑則會增加成本，同時有機溶劑也會在提取過程中揮發，因此，選擇液固比為12 mL/g進行MRDKKO的提取。

圖2 東魁楊梅種仁油單因素實驗提取結果

隨著提取時間的延長，MRDKKO的提取率得以增加，且在提取時間為40 min基本達到最大值，盡管持續增加提取時間MRDKKO的提取率有一定程度的增加，然而綜合考慮提取率與提取時間的效率問題，選取提取時間為40 min進行后續實驗。

提取溫度從20 ℃增加到40 ℃時MRDKKO提取率顯著提高，這是因為溫度的上升會加速對細胞的破壞和油脂的溶出，而過高的溫度則會導致有機溶劑的揮發，影響提取的傳質效率，從而降低提取率，因此，40 ℃作為適宜的提取溫度進行實驗。

超聲功率從100 W增加至300 W，MRDKKO的提取率呈現不斷增加的趨勢，當超聲功率超過300 W時，提取率則不再增加，這是因為超聲功率的提高會加速其對細胞的破壞，但當超聲功率持續增加會使溫度升高，一方面導致溶劑揮發，另一方面減少了溶劑與東魁楊梅種仁的接觸，最終導致提取率的下降，故300 W作為最佳的超聲功率。

2.2.2 人工神經網絡實驗

從單因素實驗結果可以分析出，液固比、提取時間、提取溫度這3個因素對MRDKKO的提取效果影響顯著，故利用ANN對這3個因素進行優化分析。在ANN優化過程中，以3個因素為輸入層，MRDKKO提取率為輸出層，構建了3-8-1的ANN模型，其中設置60%的數據為訓練集，20%的數據為驗證集，20%的數據為測試集，通過對MRDKKO提取率的ANN預測分析發現(圖3)，訓練集、測試集、矯正集及整個模型的R值分別為0.999 21、0.999 8、0.999 93和0.994 67，非常接近1，且所有數據都分布在40o線左右，表明建立的ANN模型與實驗數據的完美擬合，也進一步證明了實驗值與ANN預測值間具有良好的相關性。結合ANN模型擬合并通過軟件分析得出最佳工藝參數：液固比13.91 mL/g，提取時間40.85 min，提取溫度42.66 ℃，MRDKKO提取率為67.94%，在實際實驗操作中，選取液固比14 mL/g，提取時間41 min，提取溫度42 ℃進行驗證實驗，重復3次后MRDKKO提取率為67.87%，可以發現，模擬擬合可靠合理，結果預測準確。

圖3 實驗數據與每一步計算的神經網絡數據的散點比較圖

2.2.3 提取動力學

采用一級動力學模型對超聲有機溶劑提取MRDKKO隨提取時間變化進行研究，得到如圖4所示的動力學曲線，并經軟件擬合得到動力學參數即提取達到平衡時的提取率C∞為68.93，提取反應速率常數k為0.12，R2=0.98，數據表明采用一級動力學方程對MRDKKO的提取是適合的，同時結合C∞與k結果發現使用超聲有機溶劑提取東魁楊梅種仁在41 min左右基本達到提取平衡及最大提取率，表明超聲有機溶劑提取法提取效率較高。

圖4 超聲有機溶劑法提取東魁楊梅種仁油動力學曲線

2.3 SEM

掃描電鏡結果能夠衡量出提取方法對樣品表面的破壞程度，通常植物油脂存在于細胞內或細胞間，對樣品表面破壞的越嚴重，說明更有利于油脂滲透到提取溶劑中。由圖5可以看出未提取的樣品表面光滑，組織沒有被破壞，且有較多的油脂存在；由于索氏提取時間長，組織有一定程度的破壞，且油脂有所減少；超聲有機溶劑提取由于超聲空化力與有機溶劑的共同作用，對組織破壞的最嚴重，可以發現基本無油脂的存在。

圖5 不同方法提取油脂后東魁楊梅種仁SEM圖

2.4 DPPH自由基清除能力

如圖6所示，隨著MRDKKO濃度的增加，其DPPH自由基清除能力增加，當MRDKKO質量濃度增加至9.95 mg/mL時達到DPPH自由基的半數清除活性濃度即IC50值，與對照VC的IC50值0.067 mg/mL相比，雖然其DPPH自由基清除能力顯著低于VC，但MRDKKO為油脂類，無法直接比擬VC這種強還原劑，與其他種類的植物油脂相比，MRDKKO由于富含不飽和脂肪酸，故其作為植物天然油脂DPPH自由基清除活性較好。

圖6 東魁楊梅種仁油DPPH自由基清除能力

3 討論

本研究使用超聲有機溶劑法對東魁楊梅種仁油進行提取，分別對液固比、超聲時間、提取溫度、超聲功率4個因素進行單因素進行優化。發現液固比、提取時間、提取溫度是對東魁楊梅種仁油提取率影響較大的3個因素。超聲功率影響較小的原因是由于楊梅種仁本身質地較軟，粉碎后能夠充分與溶劑接觸，較低的超聲功率即可達到較好的提取效果，所以低功率和高功率超聲對油脂的提取率影響較小。通常在工業化生產中，不會使用超聲有機溶劑提取法進行大規模提取，這也為工業化使用其他方法對東魁楊梅種仁油的高效提取提供支持[16]。人工神經網絡法近年來在提取工藝優化等領域有廣泛應用，因其算法簡單，預測結果準確，對訓練集數據要求低等優勢明顯優于傳統的RSM法正得到越來越多的關注[17]。工藝優化是綠色化學的核心思想之一，盡量使用最少的提取溶劑、相對最短的提取時間、更低的溫度獲取到更高的得率，是工業生產中尤為重要的一環[18]。尤其是目前楊梅油產品還處于發展的萌芽階段，市面上相關產品甚少，現如今正是搶占市場的良好時間。結合前期實驗發現這可能與楊梅種子壁厚，難剝離造成的，種子難處理極大地限制了楊梅油產業的發展[19]。楊梅在我國南部各省山區分布廣泛，是一種重要的經濟作物，資源儲量充足。只有建立在綠色化學的基礎上，解決楊梅種子難剝離的問題，才能夠實現將楊梅種仁油開發為高品質食用油。

4 結論

本研究使用GC/Q-TOF MS氣質聯用儀建立一套快速、準確的針對東魁楊梅種仁油進行成分分析及結構鑒定的檢測方法。結果表明東魁楊梅種仁油中亞油酸質量分數可達38.72%，總不飽和脂肪酸質量分數高達82.20%。DPPH自由基清除活性實驗表明東魁楊梅種仁油具有較好的抗氧化活性。高不飽和脂肪酸含量、高碘值、低酸值說明東魁楊梅種仁油是一種極具潛力的天然油脂來源。

致謝：本文得到了浙江中醫藥大學中醫藥科學院醫學科研中心公共平臺盛正華老師、王林燕老師、關旸老師、王博老師的幫助與支持，以及浙江中醫藥大學中醫藥科學院醫學科研中心公共平臺提供的技術協助，特此感謝！