葡萄球菌對發酵肉制品中生物胺降解機制研究進展

段雨帆，鐘媛媛，朱 霄，陳 偉，劉冬明，2，王遠亮，

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410125；2.偉鴻食品股份有限公司，湖南 湘潭 411131）

發酵肉制品深受消費者歡迎，但在發酵肉生產過程中，常會產生一定量的生物胺。目前，通過相關技術對世界各國發酵肉制品中生物胺的含量進行測定，發現產品中腐胺、酪胺、組胺和尸胺含量較高。由于不同原料、加工方式、發酵條件以及制作過程中使用的添加劑和防腐劑等因素對生物胺形成都有影響，導致不同發酵肉中生物胺含量會有顯著性差異；同時，不同種類生物胺毒性差異較大，不同種族、地域和國家的人群對各種生物胺的敏感性也有所不同。目前國際上缺乏較為完善的生物胺膳食評估數據，只有少數國家對食品中的組胺作了嚴格限量規定。美國食品藥品監督管理局規定，水產品中生物胺總量≤1 000 mg/kg、組胺含量≤50 mg/kg、酪胺含量≤100 mg/kg；歐盟規定，食品中組胺含量≤200 mg/kg；我國GB 2733—2015《食品安全國家標準 鮮、凍動物性水產品》僅對魚類產品中的組胺作了詳細規定，其中高組胺魚類組胺含量≤40 mg/kg，其他海水魚類組胺含量≤20 mg/kg。因此，國際上還缺乏一個統一的標準來規范食品中生物胺含量。已有研究發現，發酵肉中生物胺來源主要有兩大途徑：首先，原料肉中的蛋白質在醛或酮的轉氨作用下生成脂肪族生物胺；其次，氨基酸脫羧酶陽性菌能夠利用發酵肉制品中的游離氨基酸，在脫羧作用下形成與游離氨基酸相對應的胺。后者是發酵肉制品中產生物胺的主要方式。研究發現，適量的生物胺有助于人體新陳代謝和免疫活性，但過量的生物胺不僅會導致食物風味劣變，而且其在人體內達到一定程度就會產生毒害作用，對機體神經系統和心腦血管系統等造成無法預計的損傷。因此，明確生物胺的形成途徑，并選擇恰當的方法降低發酵肉中生物胺含量尤為重要。世界不同國家及地區發酵肉制品中的生物胺種類及含量如表1所示。本文結合國內外研究報道，介紹具有降解生物胺特性的葡萄球菌菌株對發酵肉中生物胺的降解機理。

表 1 不同國家及地區發酵肉制品中的生物胺種類及含量Table 1 Types and contents of biogenic amines in fermented meat products from different countries and region

1 生物胺和葡萄球菌

1.1 生物胺

生物胺是一類含氮的脂肪族、芳香族或雜環類低分子質量有機堿，是細胞的重要組成部分，對人體有促進生長、增強代謝、提高免疫力、清除自由基等作用。最新報道發現，多胺，如胍胺在調節膜連接中發揮重要作用，此外，Galgano等發現，生物胺具有調節細胞生長、組織修復、協助基因表達、調控細胞內信號傳導途徑和離子通道等功能。同時生物胺是多發性硬化癥（multiple sclerosis，MS）發病機制中涉及的免疫系統和神經系統之間相互作用的直接介體，Melnikov等發現其既可以增強也可以抑制Th17細胞功能，而Th17細胞在MS炎癥性病變的發展中起核心作用，基于這一發現，靶向生物胺及其受體可作為一種新型的MS疾病改良療法。最近，Yue Fei等通過小鼠實驗發現，亞精胺可激活Map 1介導的自噬，延長壽命并預防肝纖維化和肝細胞癌，就此認定亞精胺可能是一種潛在的壽命延長劑。但當生物胺出現在食品中往往會帶來不利影響，如尸胺、腐胺等二胺類物質一方面能通過抑制生物胺分解酶活性，增加組胺的含量與毒性，另一方面通過結合樣品中的亞硝酸鹽產生具有致癌作用的亞硝胺，對機體造成一定影響。

目前，主要有4 種控制生物胺的方法：1）降低游離氨基酸含量；2）抑制產氨基酸脫羧酶菌株的生長；3）抑制氨基酸脫羧酶活性；4）提高生物胺的降解率。控制生物胺的形成主要可以通過改變外界環境條件實現，而利用具有胺氧化酶活性的微生物菌株是降解已生成生物胺的有效途徑。

生物胺通常是由蛋白質或游離氨基酸在微生物脫羧酶或脫亞胺酶的作用下通過一系列生化反應產生，如氨基酸脫羧作用或醛和酮的氨基化作用、轉氨作用。脫羧酶主要通過去除羧基來形成相應的胺類和二氧化碳，再選擇性作用于特定氨基酸；脫亞胺酶也是參與生物胺生物合成的酶之一，主要與腐胺的形成有關。食品中生物胺的形成主要是通過脫羧酶途徑。組氨酸（His）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）和賴氨酸（Lys）在脫羧酶的作用下分別形成組胺、酪胺、苯乙胺和尸胺等生物胺；而腐胺、胍丁胺、亞精胺等多胺可以通過多種途徑合成，如鳥氨酸和胍丁胺可作為腐胺的直接前體物質，精氨酸則可作為間接前體物質，在精氨酸脫亞胺酶和精氨酸酶的作用下，通過水解作用轉化為鳥氨酸或經脫羧反應生成胍丁胺后合成腐胺。精胺則是由腐胺、亞精胺等前體物質在亞精胺合成酶、精胺合成酶的作用下產生。生物胺合成除需要有相對應的氨基酸作為前體物質和具有氨基酸脫羧酶的微生物外，還需要適宜的外部環境條件來滿足含氨基酸脫羧酶的微生物生長以及氨基酸脫羧酶合成。

1.2 葡萄球菌

葡萄球菌是一種在顯微鏡下呈不規則葡萄串狀的革蘭氏陽性菌，極少數致病型耐藥菌株呈革蘭氏陰性；葡萄球菌是一種無鞭毛、不活動、不具有芽孢的兼性厭氧細菌，具有高度的耐鹽性（大多數葡萄球菌可在質量濃度0.1 g/mL的氯化鈉環境中存活）。截至2018年，已鑒定的葡萄球菌屬包括54 個種和27 個亞種。食品中通常存在3 種葡萄球菌：肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌和馬葡萄球菌，根據它們的遺傳特征與產生物胺含量研究，認定可以單獨或與其他微生物結合用作工業發酵過程中的發酵劑，特別是用于生產奶酪和發酵肉。在目前已知的諸多降胺方法中，添加發酵劑也被認為是最有效的方法之一。添加到發酵香腸中以減少生物胺含量的發酵劑菌株，通常是不含有氨基酸脫羧酶的安全菌株。這些菌株能夠很好地適應香腸中的環境，并抑制產胺菌的生長。作為發酵肉制品中的優勢菌種，葡萄球菌在減少樣品中生物胺含量的同時，還具有硝酸鹽還原酶活性以及較強的脂肪和蛋白質分解能力，給發酵肉帶來良好色澤的同時還賦予產品溫潤的口感，在滿足消費者對發酵肉制品食用安全性要求的同時，也有助于提高產品的感官品質。

葡萄球菌作為降胺發酵劑添加到發酵肉中，除需要保障產品安全性及符合發酵條件外，還應不產胺或產胺能力極弱。已有大量實驗證明，肉葡萄球菌不具備產生某些生物胺，如尸胺、腐胺、色胺、酪胺和組胺等的能力，雖然有極少數肉葡萄球菌菌株會通過脫羧作用由苯丙氨酸產生苯乙胺，苯乙胺是胺類的前體氨基酸，但產生苯乙胺的含量低于歐盟法典中規定的除水產品以外其他食品（包括肉制品）的允許含量（＜30 mg/kg）。Kanjan等通過薄層色譜及基于聚合酶鏈式反應的方法從相應的氨基酸中檢測擬葡萄球菌PMRS35形成生物胺的可能性，發現擬葡萄球菌PMRS35既不會產生組胺、酪胺等，也不含有這幾種胺合成的相關基因。Jeong等研究發現：琥珀葡萄球菌分離株在實驗室環境中培養一段時間，其分離物不產生組胺；此外，琥珀葡萄球菌分離株的基因組測序結果表明，所有分離株都缺少產生組胺、腐胺和酪胺所需的基因。盡管一些菌株中鑒定出了產生尸胺所需的賴氨酸脫羧酶編碼基因，但在添加過量前體的培養基中，分離株的尸胺產量平均值為75.1 mg/kg，表明前體受到限制，尸胺產量非常低，所造成的危害性很小。Ansorena等在使用木糖葡萄球菌作為發酵劑生產的香腸中沒有檢測到2-苯乙胺、腐胺、組胺和色胺。因此，利用葡萄球菌作為肉制品發酵劑來降低產品中生物胺含量是一種可行、有效的方法。

圖 1 發酵肉中生物胺形成與葡萄球菌降解生物胺途徑示意圖[1，25-26]Fig. 1 Bioamine formation and degradation by Staphylococcus in fermented meat[1，25-26]

2 葡萄球菌降胺機制

隨著研究的深入，大量研究表明，肉制品中的葡萄球菌具有降低發酵肉制品中生物胺含量的作用，其途徑主要有3 種：1）葡萄球菌具有生物胺氧化酶，可以將生物胺氧化成醛、氨和HO等物質，從而達到降胺的效果；2）葡萄球菌可以產生葡萄球菌素，葡萄球菌素作為一種細菌素具有抑制或殺滅產胺菌的能力，可以從根本上抑制生物胺的產生；3）葡萄球菌可以與其他菌株產生協同作用，更好地發揮降胺效果。因此可以考慮將通過安全性評價且符合發酵劑條件的葡萄球菌作為肉品發酵劑使用。在諸多降胺方法中，添加發酵劑也被認為是最有效的方法之一。圖1為發酵肉生物胺來源與形成以及利用葡萄球菌作為發酵劑降解生物胺的途徑示意圖。

2.1 生物胺氧化酶氧化降胺

已有研究報道，根據輔基類型不同，具有生物胺降解作用的主要有3 種酶：胺氧化酶、胺脫氫酶及多銅氧化酶。胺氧化酶具有較強的底物特異性，可以針對性地降低發酵肉中生物胺含量。胺氧化酶最早由Yamada等在黑曲霉中發現，該研究報道，當菌株在以單胺或二胺作為單一氮源的培養基上生長時，在真菌菌絲體中可以形成一種銅胺氧化酶，該酶在磷酸鹽緩沖液中可保持其活性，在pH 6.0～7.0、溫度35 ℃時穩定存在，但溫度一旦超過40 ℃其結構就被迅速破壞。之后，Sekiguchi等從成晶節桿菌KAIT-B-007中分離純化出具有熱穩定性的組胺氧化酶，通過研究其酶學特性，根據原子吸收光譜結果顯示，每摩爾該酶含有1 個Cu，并證明Cu對組胺氧化酶的活性有重要影響。

生物胺氧化酶屬于氧化還原酶類，是一種能夠氧化生物胺的特殊蛋白質。微生物學中根據輔助因子的不同將生物胺氧化酶分為2 類：一種是含銅的胺氧化酶，另一種是含黃素的胺氧化酶。根據氧化生物胺氨基數目不同又可以分為單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）和多胺氧化酶（polyamine oxidase，PAO）等。MAO多屬于含銅的氧化酶，由于最先發現的MAO以酪胺為底物，因此又叫酪胺氧化酶；DAO主要可對組胺和腐胺產生氧化作用，可用調節它們在組織中的水平；PAO是指所有能氧化多胺類物質的酶，是催化多胺氧化降解的主要酶。PAO不同于MAO與DAO，可以降解多種生物胺，如精胺、亞精胺與腐胺，因此利用PAO來降解發酵肉制品中生物胺的應用前景十分可觀。菌株降解1 種以上生物胺的能力可能是由于菌株中同時含有幾種胺氧化酶，目前已發現葡萄球菌屬中的木糖葡萄球菌可產生組胺氧化酶和酪胺氧化酶，肉葡萄球菌可產生組胺氧化酶及MAO等，也證實了這一說法。胺氧化酶主要通過2 種方式降解發酵肉中的生物胺：一種是利用MAO直接將生物胺降解成小分子物質，如酪胺等；另一種是肉制品中各種生物胺都有與之相對應的胺氧化酶，生物胺在胺氧化酶與其他酶共同作用下，通過一系列的生化反應轉化為相應的鹽類，如在腐胺氧化酶與腐胺轉氨酶的共同作用下可將腐胺轉化為4-氨基丁醛，4-氨基丁醛再在4-氨基丁醛脫氫酶作用下轉化為4-氨基丁酸，4-氨基丁酸通過氨轉移酶和脫氫酶的作用形成琥珀酸鹽，從而達到代謝腐胺的目的。

已有研究發現，發酵食品中含有生物胺氧化酶的微生物通常是乳酸菌屬與葡萄球菌屬中的某些菌種，如植物乳桿菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌等。Leuschner等報道，葡萄球菌屬中的鼠尾草葡萄球菌菌株不具有胺降解酶活性，該結果也表明菌的胺降解活性不是物種特異性的，而是菌株基因水平特異性的。Martuscelli等從意大利香腸中分離出50 株具有降解生物胺性狀的木糖葡萄球菌，菌株中的S79、S81、S90、S206組胺氧化酶活性尤為顯著，可以降低組胺含量，降幅達100%。馬宇霞等對不同熏馬腸樣品中的44 株產生物胺氧化酶菌株進行分離與篩選，篩選出具有氧化酶特性和對金黃色葡萄球菌、李斯特菌及大腸桿菌3 種致病菌有良好抑制活性的菌株，且耐鹽性和耐亞硝酸鹽性強，在使用變性梯度凝膠電泳排除重復菌株后，通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定其減少生物胺的能力，最終，利用16S rDNA的V～V序列進行聚合酶鏈式反應擴增和測序后，發現菌株中腐生葡萄球菌和木糖葡萄球菌滿足要求，可產生物胺氧化酶。鄧紅梅等通過培養基顯色法和氧化酶實驗相結合，從發酵香腸中分離產生物胺氧化酶的優勢菌，并利用HPLC檢測產生物胺氧化酶菌株對生物胺的氧化降解能力，最終獲得4 株符合發酵菌株標準并產生物胺氧化酶的葡萄球菌；通過16S rDNA分子鑒定，確定上述4 株發酵菌株中有3 株模仿葡萄球菌和1 株表皮葡萄球菌，其中模仿葡萄球菌可顯著降低多種生物胺含量。利用含生物胺氧化酶的微生物來防止食品中生物胺的合成和累積并對食品中已存在的生物胺進行降解，對發酵食品的加工工藝以及營養和風味影響甚微，是控制發酵食品中生物胺含量最有效的方法之一。但目前針對生物胺氧化酶的應用主要在于其作為活性物質對動植物生理、病理學方面的治療功效，很少直接將其運用于食品發酵工藝中，也缺乏對生物胺氧化酶的酶學性質與應用特性的深入研究。

2.2 葡萄球菌產生細菌素抑制其他產胺菌

細菌素是一種由細菌產生的抗生代謝產物，多是蛋白或多肽類化合物，主要由某些細菌的核糖體合成。細菌素的抑菌機制主要是為細菌素產生菌提供相對于其他菌株的生存優勢。1885年，某些葡萄球菌菌株在固體培養基上能抑制其他葡萄球菌生長這一現象被Babes發現，但由于當時研究條件有限，并未對此作出科學的解釋；直到1946年，由葡萄球菌產生的細菌素才正式被定義為葡萄球菌素。并非所有的葡萄球菌菌株都具有產細菌素能力，但有的葡萄球菌又可以產生一種或多種葡萄球菌素。葡萄球菌產細菌素的能力取決于菌株基因組中細菌素基因簇是否完整表達。迄今為止，主要的葡萄球菌素產生菌包括表皮葡萄球菌及金黃色葡萄球菌。大部分葡萄球菌素在抵抗細菌，包括一些病原菌方面具有廣譜性。由于葡萄球菌素具有殺死競爭菌并與免疫系統相互作用的能力，認為產葡萄球菌素是葡萄球菌作為益生菌的特性。

發酵肉制品中最常見的生物胺主要是腐胺和尸胺，組胺是最重要且毒性最大的生物胺之一，發酵肉制品中的生物胺氧化酶主要由脫羧酶陽性菌產生，主要有假單胞菌屬、腸桿菌屬、酵母菌、乳酸菌和腸球菌屬等。組胺含量取決于弧菌屬、發光桿菌屬、克雷伯氏菌屬和莫爾甘內拉氏菌屬微生物，酪胺主要與肉毒桿菌、腸球菌和彎曲乳桿菌有關，而腐胺和尸胺主要與腸球菌有關。這些微生物可能存在于原料和環境中，對生物胺的產生起著關鍵作用。李宗軍研究不同碳源對傳統酸肉菌群結構與生物胺含量的影響，發現腐胺和尸胺主要由腸桿菌中的陰溝腸桿菌、沙雷氏菌產生，酪胺的生成主要與腸球菌有關。Mah等從314 株菌株中篩選出不具有產生物胺能力的木糖葡萄球菌0538，發現其不僅具有降解組胺的能力，而且在體外具有細菌素抑菌活性，可以抑制地衣芽孢桿菌（一種產胺菌）的活性，且其在含有0.5 mmol/L組胺和0.5 mmol/L酪胺的磷酸鹽緩沖液中，24 h可以降解38.0%組胺和4.4%酪胺。Sandiford等發現，表皮葡萄球菌素NI01在一定濃度范圍內對金黃色葡萄球菌、腸球菌等具有強大的抗菌活性，通過抑制產胺菌的生理活性起降胺作用。Fagundes等從葡萄球菌3682中發現的細菌素Hyicin 3682不僅具有廣譜抗菌特性，而且在食品中具有潛在的防腐作用，可以延緩食品腐敗、減少食源性疾病的發生。目前已有研究表明，產細菌素的乳酸菌可用于防止香腸中病原菌生長，為之后利用葡萄球菌素抑制產胺菌的生長、降低發酵肉中的生物胺含量提供了參考。但目前利用葡萄球菌產生的細菌素來抑制其他產胺菌生長的具體研究還十分有限，需要進一步的探究。

2.3 葡萄球菌協助其他菌株降胺

Zaman等測定魚露中組胺、腐胺和尸胺含量，并對從樣品中分離的細菌胺降解活性進行評價。結果表明，33 株細菌分離株中，8 株具有降胺能力的菌株被進一步鑒定和評估，其中解淀粉芽孢桿菌FS-05和肉葡萄球菌FS-19對組胺的降解率分別為59.9%和29.1%，中間葡萄球菌FS-20和枯草芽孢桿菌FS-12對腐胺和尸胺的降解率分別可達30.4%和28.9%以上。高文霞等發現，添加木糖葡萄球菌有助于戊糖片球菌進一步降低薩拉米香腸中生物胺的含量，較以單一戊糖片球菌作為發酵劑，組胺含量多降低14.55%，與不添加發酵劑組相比組胺含量降低32.20%。譚李紅等通過測定發酵香腸中酪胺和色胺含量，進一步證實復合發酵劑降解生物胺效果更佳，通過結合微生物菌落計數結果發現，木糖葡萄球菌主要通過抑制乳酸菌及其他雜菌的繁殖，從而為戊糖片球菌提供了適宜的生存環境，更加有利于其降解生物胺作用。Lu Shiling等發現，在發酵香腸中使用費氏乳桿菌與腐生葡萄球菌組成的復配發酵劑，對組胺、腐胺、尸胺和酪胺的產生均有明顯抑制作用。孫欽秀等將植物乳桿菌、木糖葡萄球菌作為發酵劑接種至香腸中，發現部分產生物胺的微生物，如腸桿菌豐度顯著降低，直接減少了香腸中生物胺（酪胺、腐胺、尸胺、組胺、2-苯乙胺和色胺）的含量，對硫代巴比妥酸反應物值等指標也有影響，進一步證明木糖葡萄球菌在保證樣品安全性的同時，還能促進風味物質的形成，得到高品質的風干香腸。朱志遠等將香腸乳桿菌、肉葡萄球菌和腸膜明串珠菌3 種發酵劑以不同的組合方式接種到香腸中，發現香腸乳桿菌和肉葡萄球菌共同發酵香腸后，可以有效抑制色胺、腐胺、尸胺、組胺的生成；添加腸膜明串珠菌和肉葡萄球菌可以降低香腸中苯乙胺和酪胺含量，且這2 種組合方式的復合發酵劑降胺效果均優于單獨使用肉葡萄球菌作為發酵劑。Xie Chong等將木糖葡萄球菌與植物乳桿菌作為發酵劑添加入香腸中，發現單獨添加木糖葡萄球菌能降低酪胺、組胺和尸胺含量，降幅分別為21%、25%、22%，而接種混合發酵劑可以徹底降解苯乙胺和色胺以及86%腐胺、82%組胺、63%尸胺和43%酪胺。

3 結 語

生物胺已經成為肉制品中無法避免的一類風險物質，嚴格控制肉制品中生物胺的含量對于保障人體健康具有重要意義。控制發酵過程中相關的各種因素是降低生物胺含量的有力保障，利用微生物作為發酵劑來抑制發酵肉中的生物胺是近年來最有效的方法之一。葡萄球菌屬中的木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌等作為發酵肉制品中的優勢菌種，不僅有利于發酵肉的風味、色澤，而且對人體安全無害，因此成為降解發酵肉中生物胺的首要選擇，但是降解過程中胺氧化酶的催化機理以及與生物胺的結合位點仍有待進一步研究。為擴大發酵劑菌株在食品產業的應用前景和技術優勢，開發各種新型優良發酵劑以及各種混合發酵劑來全面、高效地降低發酵肉生物胺含量將成為今后的研究熱點。目前的研究主要集中于降胺菌株的最佳作用條件及降解效率，忽視了與發酵產品總體環境的協調性；此外，從實驗室研發到真正將這些降胺菌株應用于發酵食品生產這一過程的實現也仍需要考慮和探索。同時，目前我國乃至世界各國都缺乏對發酵肉制品中生物胺的詳細限量標準，急需科研人員在此方面開展系統研究，制定不同生物胺的限量。同時依據風險評定結果，建立合理的監測限量體系，規范生產管理，降低生物胺含量，提高產品質量和安全性，保障消費者身體健康。