二精方對Ⅱ型糖尿病氧化應激作用實驗研究

趙 雨，褚海清，王結鑫，王淵學，梁 凱，張立明，2，3*

(1.寧夏醫科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏特色中醫藥現代化工程技術研究中心，寧夏 銀川 750004；3.回醫藥現代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetesmellitus，T2DM)是一類由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損引起的、導致全身代謝出現紊亂進而長期損害人體多個器官的全身性代謝性疾病。氧化應激與T2DM的發展緊密相關，T2DM的表現形式之一就是自由基和活性氧生成增加，有研究報道，當機體受到刺激時，體內會產生過量的氧自由基，自由基過多將會打破氧化與抗氧化之間的動態平衡，誘發氧化應激，直接損傷細胞，減少胰島素分泌，進而會促進糖尿病癥狀加重及其多種并發癥的發生[2]，所以氧化應激反應在Ⅱ型糖尿病中發揮著重要作用。

二精方由枸杞、黃精組成，在《圣濟總錄》中早有記載，這兩味藥均是滋陰補腎藥，且均為藥食同源中藥，食物綠色無害，藥物防治疾病，食物和藥物一樣可以用于治愈患者[3-4]，因此枸杞-黃精具有很好的開發價值。研究表明，枸杞具有調節免疫、保護心血管、抗氧化、保護眼睛、預防糖尿病等作用[5-6]，黃精具有抗氧化、降低血糖、降低血脂、調節免疫力、強心、抗炎、抑菌、抗腫瘤等功效[7]，兩者對于糖尿病都有一定的防治作用。本實驗所用二精方提取液是由枸杞-黃精按1∶1組合，經提取濃縮制得。本課題通過研究二精方提取液對機體氧化應激各項指標的影響來探討二精方對Ⅱ型糖尿病模型大鼠的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

自寧夏醫科大學實驗動物中心購買60只SPF級SD雄性大鼠，體質量180～200 g，飼養于寧夏醫科大學實驗動物中心實驗室。實驗動物合格證號：SCXY(寧)2015-0001。

1.2 藥物及試劑

二精方提取液制備：按枸杞-黃精(1∶1)的比例稱取飲片，75%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，合并2次濾液并濃縮。鹽酸二甲雙胍片(規格0.5 g/片，中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：AAU9951)。

鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司，100 mg/瓶，CAS NO：18883-66-4)：丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)試劑盒，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 動物模型制備與實驗分組[8]

60只健康雄性SD大鼠，適應性喂養3天，按體質量隨機分為6組，每組10只，隨機選取1組作為空白對照組行普通飼料喂養，其余5組50只高糖高脂飼料誘導8周后腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)35 mg/kg造模，空白對照組大鼠腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液，期間禁食不禁水12 h；1天后，再次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg，空白對照組大鼠腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液，期間禁食不禁水12 h。腹腔注射7天后尾部取血用血糖儀測血糖，以血糖水平大于 11.1 mol/L，并伴有多尿癥狀的大鼠作為成模大鼠進行實驗。造模成功后將成模大鼠分為模型組、二甲雙胍組、二精方提取液高劑量組、中劑量組、低劑量組。模型組、空白對照組給予生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃，二精方提取液高劑量組給予1.7 g/(kg·d)灌胃，中劑量組給予3.4 g/(kg·d)灌胃，低劑量給予6.8 g/(kg·d)灌胃，二甲雙胍組給予二甲雙胍250 mg/(kg·d)灌胃，造模成功后進行藥物干預，每天1次，共30天。

2.2 觀察指標

2.2.1 大鼠一般狀態 每天觀察大鼠1次，查看其有無毛色、活動和精神狀況異常，每周稱量并記錄1次大鼠體質量，監測其體質量增長情況。

2.2.2 MDA、SOD、GSH-Px、CAT、HK、PK水平 造模及給藥結束后，麻醉后處死大鼠，于各組大鼠股動脈取血，將取得的血液實驗室溫度中靜置20 min，3 000 r/min高速離心10 min，取血清置于EP管中，置于-80 ℃冰箱中備用，采用酶聯免疫吸附法對丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)指標進行檢測。并摘取各組大鼠肝臟，沖洗凈血液，快速分離肝臟組織，置于凍存管內于-80 ℃冰箱保存備用，按相關試劑盒具體操作說明測定肝臟中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)水平。

2.3 統計學處理

3 結果

3.1 大鼠的一般狀態比較

除空白對照組外，各組大鼠在喂養高糖高脂飼料期間，體質量與初始質量相比較均有所增加。造模成功后，模型組大鼠逐漸出現多飲、多食、多尿現象，且體質量下降明顯。而空白對照組一般狀況良好，進食、飲水量、尿量均正常。

給藥后，與模型組相比，二精方提取液低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠的一般狀況有所好轉，多飲、多食、多尿現象癥狀減輕，體質量下降趨勢也有所減慢。與空白對照組相比，癥狀仍較明顯。

3.2 各組大鼠血清MDA、SOD、GSH-Px水平比較[9]

與空白對照組相比，模型組MDA含量顯著升高(P<0.01)；SOD活性水平顯著下降(P<0.01)；GSH-Px活性水平顯著下降(P<0.01)。與模型組相比，陽性組、二精方提取液高、中、低劑量組MDA含量均有極顯著性的降低(P<0.01)。SOD活力水平：相比較于模型組，陽性組、二精方提取液中和高劑量有顯著性提高，低劑量組無顯著性提高(P>0.05)。GSH-Px活力水平：相比較于模型組，陽性組、高劑量組有顯著性提高，中、低劑量組無顯著性差異(P>0.05)。結果見圖1、圖2。

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 各組大鼠肝臟MDA、SOD、GSH-Px水平比較

與空白對照相比，模型組MDA含量顯著升高(P<0.01)；SOD活性水平顯著下降(P<0.01)；GSH-Px活性水平顯著下降(P<0.01)。與模型組相比，二甲雙胍組、二精方提取液高、中劑量組MDA含量均有極顯著性的降低(P<0.01)，低劑量組大鼠MDA含量降低，但無顯著性差異(P>0.05)。SOD活力水平：相比較于模型組，二甲雙胍組、二精方提取液高、中、低劑量組均有極顯著性提高。GSH-Px活力水平：相比較于模型組，二甲雙胍組、二精方提取液高、中、低劑量組均有極顯著性提高(P<0.01)。結果見圖3、圖4。

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 各組大鼠肝臟CAT、HK、PK水平比較

與空白對照組相比，模型組CAT、HK、PK活力水平極顯著下降(P<0.01)。其中CAT活力和HK活力：與模型組相比，陽性組、二精方提取液高、中、低劑量組有極顯著性提高(P<0.01)；PK活力：二精方提取液中、高劑量組相比于模型組有顯著性提高，低劑量組比模型組有提高，但是無顯著性差異(P>0.05)。結果見圖5。

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

2017年版《中國Ⅱ型糖尿病防治指南》顯示，隨著人們生活、飲食習慣的改變，糖分攝取不斷增多，我國Ⅱ型糖尿病發病趨勢日趨年輕化，發病率也逐漸升高。有研究證實，糖尿病患者發病過程中伴隨著明顯的氧化應激反應[10]，據此，降低氧化應激反應、提高患者抗氧化能力可以成為我們研究T2DM的重點方向。氧化應激是指高活性反應分子ROS在體內大量產生，導致體內自由基、活性氧等物質過多堆積，機體氧化和抗氧化作用之間的動態平衡被打破，進而引起組織損傷的一種異常生理狀態[11]。通常情況下，機體自由基的產生和清除處于一種動態平衡狀態，當疾病產生時，這種平衡被打破，機體產生大量自由基，引起氧化應激造成組織器官損傷。糖尿病的一種表現形式就是自由基和高活性反應分子ROS增多，氧化與抗氧化失衡，ROS活性分子直接氧化和損傷DNA、蛋白質、脂類等。這些現象都表明糖尿病與氧化應激密切相關[12]。

二精方是經典古方，又名二精丸，《奇效良方卷之二十一·諸虛門》中記載：“常服助氣益精，補填丹田，活血駐顏，長生不老。”現代藥理學研究表明，二精方具有很好的降糖降脂、改善記憶作用。白素芬等[13]發現二精丸多糖可顯著降低糖尿病大鼠血糖、糖化血紅蛋白(HbAlc)含量，對糖尿病所引起的“三多一少”等癥狀有所緩解。劉海霞等[14]研究表明，枸杞子水提物有助于防治與氧化應激相關的糖尿病并發癥。因此本實驗聚焦氧化應激，通過構建糖尿病大鼠模型探討二精方中有效成分與氧化應激調節之間的作用關系與機制。

本實驗結果中，與模型組相比，二精方提取液組MDA含量都有所降低，SOD、GSP-Px、CAT、HK、PK活力水平均有一定程度的提高。其中二精方提取液高、中劑量組血清MDA、SOD，肝臟MDA、SOD、GSP-Px、CAT、HK、PK與模型組比較都有極顯著差異(P<0.01)。低劑量組對各組大鼠血清MDA、SOD、GSP-Px的影響都不甚明顯(P>0.05)。MDA是生物膜脂質過氧化的產物，其含量升高能間接表明體內氧自由基增多，氧化程度加深。隨著自由基的增多，脂質過氧化增強，生物膜隨之受損，最終導致組織損傷。而GSP-Px作為一種清除酶，能夠將體內的過氧化物和脂質過氧化物清除，減輕對組織的損傷。SOD是一種清除O2-的金屬酶，其活性能夠反映抗氧化能力。己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)在糖酵解過程中起著重要作用，是葡萄糖分解過程中關鍵限速酶，其活性的增強能加快糖降解，起到降低血糖的作用。過氧化氫酶(CAT)是一種酶類清除劑，可促進過氧化氫分解，從而保護抗氧化系統。因此可以通過MDA、SOD、GSP-Px、CAT、HK、PK來反映機體的氧化程度和抗氧化的能力。此外，與空白組相比，模型組大鼠肝臟大鼠血清MDA顯著提高，SOD、GSH-Px活性水平顯著下降，CAT、HK、PK活力水平極顯著下降(P<0.01)，這表明糖尿病大鼠模型自由基損傷程度加重，抗氧化能力下降，清除率降低，ROS增多對組織的損傷加重，氧化應激反應增強[15]。

綜上所述，二精方提取液可改善T2DM模型大鼠的血糖水平，增強抗氧化活性和清除自由基能力，保護ROS增多引起的組織損傷，有助于防止與氧化應激相關的糖尿病并發癥，并加快糖酵解，起到降低血糖和防治糖尿病的作用。