人冠狀病毒229E 寒濕疫毒襲肺證病證結合小鼠模型的建立及評價

耿子涵包 蕾郭姍姍時宇靜鮑巖巖趙榮華孫 靜高英杰崔曉蘭

(中國中醫科學院中藥研究所,北京 100700)

病毒性肺炎是由病毒引起的單側或雙側肺部炎性病變。 基于上千年的經驗和積累,中醫藥在歷次病毒性肺炎疫情的防治中發揮了重要的作用,在緩解臨床癥狀、縮短療程、促進治愈等方面取得了良好的效果。 不論是緩解急性重癥呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)的急性早期癥狀[1],在甲型H1N1 流感的辨證治療[2],還是在新型冠狀病毒性肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)疫情中[3-7],復方中藥或中成藥均在臨床應急治療中發揮了積極作用。

與此同時,提供實驗數據與臨床相互驗證,也顯得尤為重要,這對有效藥物的篩選、尋找其作用靶點、進一步推動中醫藥在臨床應用具有現實意義。 考慮到中醫藥治療的特點是并不針對某一特定病毒,而是基于對其病因病機的認識進行辨證論治,主要注重機體整體狀態、特別是對機體免疫狀態的調節[8],建立符合中醫藥特點的病毒感染動物模型十分必要。 中藥藥效評價的模型著重于中醫證候、疾病表現與臨床癥狀的一致性,而不局限于特定的病毒感染。 由寒、濕之邪導致的“寒濕疫毒襲肺證”是一種可見于病毒性肺炎早期的中醫證候[9-11],在本研究中,我們以寒濕疫毒襲肺證以及病毒性肺炎疾病的典型臨床表現作為參照,使用人冠狀病毒229E(hCoV-229E)疊加寒濕刺激的方法,建立hCoV-229E 寒濕疫毒襲肺證病證結合模型,對病毒的感染條件和模型小鼠的表現進行摸索和評價,為治療以該證候為表現的肺炎的有效藥物篩選和臨床應用提供源自動物實驗的科學數據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

72 只 21 ～ 28 日齡 BALB/c 小鼠,SPF 級,雌雄各半,體重(14±1)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2021-0006]。 小鼠飼養于中國中醫科學院中藥研究所ABSL-2 實驗室[SYXK(京)2019-0003]。 所有動物實驗均遵循美國國立衛生研究院(NIH)及北京市實驗動物倫理委員會的規定,經過中國中醫科學院中藥研究所動物倫理委員會批準(2020D007),實驗遵循3R 原則。

1.1.2 細胞

人肺癌細胞系A549(BNCC337696)、人胚肺成纖維細胞系MRC-5(BNCC338054),均購自北京北納創聯生物技術研究院。

1.1.3 病毒株

hCoV-229E 毒株由中國醫學科學院醫藥生物技術研究所提供,由中藥研究所BSL-2、ABSL-2 實驗室保存及傳代。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清(fetal bovine serum, FBS),批號35081003,Dulbecco’s modified Eagle’s(DMEM)培養基,批號 33218004,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS),批號18919010,均購自美國康寧公司；青霉素鏈霉素雙抗(Penicillin Streptomycin,PS),批號1796440,胰蛋白酶,批號2048080,均購自美國Gibco 公司；甲醛溶液,批號 F20180825,二甲苯,批號20170705,購自國藥集團化學試劑有限公司； QIAamp 病 毒 RNA 純 化 試 劑 盒, 批 號163052733,購自凱杰企業管理上海有限公司；TRIzol Reagent,批號257403,購自美國 Life 公司；Human Coronavirus(hCoV-229E)Real time RT-PCR kit,批號P20191201,購自上海之江生物科技股份有限公司；Mouse Gas ELISA Kit,批號02/2020,Mouse MTL ELISA Kit,批號02/2020,均購自上海酶聯生物技術有限公司；Mouse IL6 ValukineTMELISA Kit,批號951928,Mouse IL10 ValukineTMELISA Kit,批號185314, Mouse TNF-α ELISA Kit, 批 號 266117,Mouse INF-γ ELISA Kit,批號 352764,均購自美國bio-techne 公司；無水乙醇,批號20180208,伊紅,批號20150915,購自北京化工廠；4%細胞組織固定液,批號DE0094,購自北京拜爾迪生物技術有限公司；蘇木素染色液,批號DH0001/0405A17,購自北京博瑞捷科技有限公司；PerCP-Cyanine5.5 標記抗小鼠CD4(RM4-5),批號65-0042,APC 標記抗小鼠CD8a(53-6.7),批號 20-0081,PE 標記抗小鼠 CD19(1D3), 批 號 50-0193, 紅 細 胞 裂 解 液, 批 號B4300083019TN,均購自美國 TONBO biosciences公司。

驗證用藥使用《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)》中的寒濕疫方[12-13],組成為:生麻黃6 g、生石膏15 g、杏仁 9 g、羌活 15 g、葶藶子15 g、貫眾 9 g、地龍 15 g、徐長卿 15 g、藿香 15 g、佩蘭9 g、蒼術15 g、云苓45 g、生白術30 g、焦三仙9 g、厚樸15 g、焦檳榔9 g、煨草果9 g、生姜15 g,由中國中醫科學院中藥研究所中藥藥理研究中心制備,批次20200318。 給藥量根據 Meeh-Rubner 公式,以人體給藥劑量推算小鼠的等效劑量,生藥量105.6 g/(kg·d)為臨床2 倍劑量,52.8 g/(kg·d)為臨床等倍劑量。

A2 型生物安全柜,型號MCS-Advantage 1.8,購自美國Thermo 公司；智能人工氣候箱,型號RXZ-380B,購自寧波江南儀器廠；電子分析天平,型號AR1140 MAX110 g,購自美國 Ohaus 公司；電子天平,型號AL204 MAX210 g,購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；IVC 小鼠飼養籠,型號ZJ-4,購自蘇州市馮氏實驗室動物設備有限公司；Buxco 小鼠霧 化 吸 入 系 統, 購 自 美 國 DSI； 離 心 機, 型 號Centrifuge 5430,購自德國Eppendorf 公司；石蠟包埋機,型號EG 1140 H,自動染色機,型號XL 5010,購自德國Leica 公司；全自動輪轉式切片機,型號HM 355 S,購自德國Microm 公司；全景組織定量分析系統, 型 號 Tissue FAXS Plus, 購 自 奧 地 利TissueGnostics 公司；小動物 Micro-CT,型號 Inveon MM,購自德國 Siemens 公司。 Real-time PCR 儀,型號QuantStudio 5,購自美國Applied biosystems 公司；八連排管迷你離心機,型號LX-300,迷你渦旋振蕩器,型號OL-901,均購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；多功能酶標儀,型號Enspire,購自德國PerkinElmer 公司；流式細胞儀,型號Accuri C6 Plus,購自美國BD 公司。

1.3 方法

1.3.1 病毒株傳代與感染

病毒液接種在A549 細胞中,在細胞維持培養基(含2% FBS 的培養基)中培養72～96 h 并觀察細胞病變,并將細胞及培養液于-80℃下凍融后取上清,采用Reed-Muench 法梯度稀釋病毒,測定半數組織培養感染劑量(median tissue culture infective dose, TCID50)[14],分裝保存于-80℃。 在驗證小鼠肺組織中是否存在活病毒的實驗中,取各組小鼠的全肺組織與 PBS 進行勻漿,取勻漿上清接種于MRC-5 細胞,鏡下觀察細胞病變情況。 所有病毒相關實驗均在生物安全柜中操作。

1.3.2 hCoV-229E 寒濕疫毒襲肺證病證結合小鼠模型的建立

將模型組小鼠置于人工氣候箱中,(4±2)℃,相對濕度(90±3)%,每天放置4 h 至實驗結束,首次放置為第1 天。 于第5、6 天輕度麻醉小鼠,取生理鹽水稀釋的病毒懸液,以100 倍TCID50、體積為50 μL的病毒稀釋液滴鼻感染BALB/c 小鼠。 相應的50 μL 正常細胞培養上清用于正常組小鼠滴鼻。 以僅放置于人工氣候箱中的小鼠作為寒濕對照,以正常環境下飼養的感染小鼠作為感染對照,以正常環境下飼養且未進行病毒感染的小鼠作為正常對照。在造模期間對各組小鼠寒濕疫毒襲肺證相關的行為表征進行評價,并于第8 天進行肺指數、肺組織病毒載量、肺部CT、肺組織中的炎性細胞因子、外周血淋巴細胞百分比等的檢測。

1.3.3 寒濕疫毒襲肺證相關行為表征的評價

造模后,分別于第 2、4、6、8 天進行行為表征觀察和評分,包括行為狀態(扎堆不動=1,少動=2,適度活動=3,活躍=4,興奮多動=5),精神狀態(遲滯=1,倦怠=2,適度=3,易激惹=4,躁怒=5),皮膚毛發狀態(枯亂=1,不澤=2,順澤=3,潮濕=4,油膩=5),糞便狀態(便硬結=1,干燥=2,適宜=3,粘膩=4,便溏=5),并于第7～8 天測定平均食物和水攝入量(計算方法為攝食或飲水總量/該組小鼠數量)。

1.3.4 小鼠肺組織病理分析

將在細胞組織固定液中固定后的小鼠肺組織用乙醇和二甲苯進行脫水,并進行石蠟包埋。 將蠟塊切為4～6 μm 的切片,置于載玻片,烤片烘干。 石蠟切片經蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色后,于光學顯微鏡下觀察肺組織病理變化并拍照。根據組織病理學改變,對各組小鼠肺組織進行評分,其中,無炎性滲出、水腫、明顯出血紅染=0,肺間質有輕度炎性滲出,肺細支氣管及周圍無明顯炎癥=1,肺間質輕度滲出炎癥,有少量出血紅染,肺細支氣管周圍輕度炎性滲出=2,肺間質出血紅染,伴肺泡塌陷、組織水腫、炎性滲出=3。

1.3.5 hCoV-229E 核酸提取與擴增

取小鼠左肺組織,使用TRIzol Reagent 提取肺組織RNA。 使用hCoV-229E Real time RT-PCR Kit,按說明書操作進行HCoV-229E 核酸的擴增,采用QuantStudio 5 Real-time PCR 儀進行熒光信號檢測。其中FAM 通道Ct 值小于等于38 h 為病毒RNA 陽性,并根據試劑盒中陽性對照品的標準曲線計算病毒載量。

1.3.6 酶聯免疫吸附試驗( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)

取小鼠血清,按ELISA 試劑盒操作說明檢測小鼠血清中的胃動素、胃泌素水平。 取小鼠右肺肺組織50 mg 置于2 mL PBS 中進行超聲勻漿,取勻漿上清,按ELISA 試劑盒操作說明檢測肺組織中白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-10、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α )、 γ 干 擾 素(interferon-γ, IFN-γ)水平。 使用酶標儀檢測 450 nm 處的吸光度值,并根據標準曲線及樣品稀釋倍數計算上述各指標的濃度。

1.3.7 流式細胞術

取抗凝小鼠全血150 μL,按流式抗體及紅細胞裂解液說明書,分別加入抗小鼠CD4、抗小鼠CD8a以及抗小鼠CD19,于4℃避光孵育30 min 后,加入2 mL 1×裂解液重懸細胞,室溫孵育5 ～10 min 直至溶液由紅色渾濁變為紅色澄清,立即加入10 mL PBS 終止裂解,1600 r/min 4℃離心5 min,棄去上清,用含2% FBS 的PBS 將4%細胞組織固定液稀釋為2%,重懸細胞,4℃保存并盡快使用 Accuri C6 plus 流式細胞儀收集細胞,使用 FlowJo 軟件進行分析。

1.3.8 驗證用藥的給藥方法

在造模的第5 ～7 天,每天進行1 次灌胃給藥,高劑量組105.6 g/(kg·d),低劑量組52.8 g/(kg·d),體積 20 mL/(kg·d)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 動物模型的建立

選擇體重(14±1)g,約為 3 ～4 周齡的 BALB/c幼鼠,構建hCoV-229E 寒濕疫毒襲肺證病證結合模型。 采用參考文獻[15]模擬寒濕環境刺激,并使用100 TCID50的hCoV-229E 進行滴鼻,誘導小鼠肺部炎癥。 其分組與步驟如圖1 所示,以模型小鼠開始放置于人工氣候箱為造模第1 天,其中正常組小鼠飼養于正常環境且不進行感染；感染組小鼠飼養于正常環境,在第5 天和第6 天用病毒各滴鼻感染1次；寒濕組小鼠從第1 天起每天置于人工氣候箱中4 h,但不進行感染；模型組小鼠從第1 天起每天置于人工氣候箱4 h,并在第5 天和第6 天進行2 次滴鼻感染。

圖1 病證結合模型小鼠的構建方法Figure 1 Methods to establish the disease-syndrome combination mouse model

2.2 動物模型的鑒定和評價-中醫寒濕證表現

為了明確模型小鼠是否具有中醫寒濕證相關的行為表征,于造模第2 天開始對小鼠的行為狀態、精神狀態、皮膚毛發狀態以及大便狀態進行評分。結果發現,造模第2 天,寒濕組小鼠開始出現皮膚毛發潮濕,相應評分增加,其他行為表征均未出現異常；造模第4 天,與正常小鼠相比,寒濕組小鼠行為狀態評分較低,精神、皮膚毛發狀態評分增高,大便狀態評分也較高；造模第6 天,與正常小鼠相比,寒濕組小鼠的行為狀態評分較低,皮膚毛發狀態、大便狀態評分均升高；感染組小鼠的行為評分變化趨勢與寒濕組相似,但毛發和糞便更為干燥；模型組與寒濕組小鼠各項行為表征均較為一致,其中行為和精神狀態的變化更為明顯。 對比造模第8 天各組每只小鼠的評分,發現暴露于寒濕環境中的寒濕組和模型組小鼠的行為和精神狀態評分低于正常,且毛發油膩、便溏,皮膚毛發和大便狀態評分高于正常,與寒濕證相關文獻報道一致[16]；而感染組的行為和精神狀態評分明顯下降,皮膚毛發則表現為干枯,大便硬結(圖2A)。

觀察各組的平均攝食量、攝水量(攝食或飲水總量/該組小鼠數量),發現與正常組相比,模型組的攝入量較低；感染組和寒濕組與正常組相比攝食、攝水量減少,但高于模型組(圖2B)。 以上結果表明模型小鼠能夠表現出與中醫寒濕證相吻合的外觀和行為特征。

圖2 病證結合模型小鼠的建立及行為表征評價(, n=10)Note. A, Evaluation of behavior scores at the 2nd, 4th, 6th and 8th day. B, Average food intake and average water intake of each group (total food or water intake of each group) measured for 24 h from the 7th to 8th day. On the 8th day, compared with normal group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 2 Establishment of the disease-syndrome combination model mice and evaluation of its appearance and behavior

2.3 動物模型的鑒定和評價-基于現代醫學的評價指標

為了明確該病毒是否會引起小鼠肺炎,對各組小鼠肺組織進行hCoV-229E 核酸擴增,并觀察肺部的組織病理學和影像學變化。 結果顯示,感染組以及模型組小鼠肺組織病毒RNA 均呈陽性,其中模型組小鼠肺病毒載量顯著高于感染組,提示寒濕環境可進一步促進病毒進入肺組織(圖3A)。 肺指數計算結果顯示,在各組小鼠體重無顯著性差異的前提下,與正常組相比,感染組及模型組小鼠肺指數顯著升高(圖3B、3C)。 隨后,將各組小鼠肺組織勻漿上清接種至MRC-5 細胞中,發現與正常培養的細胞相比,正常小鼠的肺組織勻漿上清使細胞形態略有改變,而感染組和模型組上清接種后造成了明顯的細胞病變(圖 3D),其 TCID50分別為 10-5.23和10-6.15,提示感染組和模型組小鼠肺組織中均存在活病毒。

圖3 各組小鼠的肺指數及病毒活性檢測(, n=10)Note. A, Real time RT-PCR amplification of hCoV-229E nucleic acid extracted from mice lung tissues. B, Body weight of mice measured at the 8th day.C, Lung index of mice. D, Microscopic cell morphology of MRC-5 cells of each group. Compared with normal group,**P＜0.01. Compared with hCoV-229E group,＃＃P＜0.01.Figure 3 Detection of lung index and virus activity of each group

HE 染色結果顯示,正常組的肺組織結構正常,肺組織未見明顯腫脹,肺間質未見明顯瘀血或炎性滲出；寒濕組觀察到輕度出血、肺組織細胞增生和炎癥浸潤；感染組和模型組小鼠肺組織均出現大面積出血紅染、肺泡支架塌陷,伴有肺泡上皮增生和炎性細胞浸潤(圖4A)。 與正常組相比,模型組支氣管的組織病理學評分顯著升高,感染組及模型組的肺病理學評分明顯升高(圖4B、4C)。Micro-CT 結果顯示,感染組和模型組小鼠肺靜脈明顯增粗,可觀察到斑點狀陰影(圖4D)。 以上結果表明,模型小鼠除表現出中醫寒濕證相關的行為表征外,肺部也表現出與病毒性肺炎相似的炎性改變。

圖4 各組小鼠的肺部病理學和影像學改變(, n=5)Note. A, HE staining of lungs. B, Histopathological scores of bronchioles. C, Histopathological scores of lungs. D, Micro-CT of mice lung in each group. Compared with normal group,*P＜0.05,**P＜0.01.Figure 4 Pathological and imaging changes of mice lung in each group

在外周血生理生化指標方面,對本模型小鼠外周血中的CD4+和CD8+T 細胞以及B 細胞的百分比進行檢測,結果發現與正常組相比,模型組小鼠T和B 細胞的百分比均顯著降低(圖5A)。 寒濕組的淋巴細胞也呈減少趨勢,提示病毒和寒濕的刺激均可造成細胞免疫功能受損。 對各組小鼠血清中的胃動素和胃泌素水平進行檢測,發現與正常組相比,寒濕組和模型組胃泌素水平顯著降低,而其它3組的胃動素水平顯著升高,其中模型組小鼠胃動素水平最高(圖5B),提示寒濕組以及模型組小鼠胃腸功能受損。

圖5 各組小鼠外周血生理生化指標變化情況(, n=10)Note. A, Frequency of T and B lymphocytes in peripheral blood. B, Level of serum gastrin and motilin. Compared with normal group,**P＜0.01.Figure 5 Physiological and biochemical changes in peripheral blood of mice

對各組小鼠肺組織勻漿中細胞因子的水平變化情況進行檢測,結果顯示,與正常組相比,寒濕組的4 種細胞因子無明顯差異,感染組和模型組的IL-6、IL-10 和 TNF-α 水平顯著升高(圖 6A ～6C)；各組IFN-γ 水平無統計學差異(圖6D)。 以上結果顯示,模型小鼠外周血淋巴細胞比例降低,肺組織中的炎性細胞因子水平升高,與人冠狀病毒肺炎的臨床表型類似。

圖6 小鼠肺組織勻漿中的細胞因子水平(, n=10)Note. A, Level of IL-6 in lung homogenates of each group. B, Level of IL-10 in lung homogenates of each group. C, Level of TNF-α in lung homogenates of each group. D, Level of IFN-γ in lung homogenates of each group. Compared with normal group,**P＜0.01.Figure 6 Cytokines level in lung homogenates of mice

2.4 動物模型的鑒定和評價-中藥復方驗證

為了對該小鼠模型在藥效評價中的可靠性進行明確,使用能夠治療寒濕疫毒襲肺證的復方中藥“寒濕疫方”[13],以臨床2 倍劑量(高劑量)和等倍劑量(低劑量),從第5 天開始每天進行給藥。 結果發現,在小鼠中醫證候方面,與模型組相比,給藥治療能夠恢復小鼠的平均攝食、飲水量(圖7A),能夠緩解小鼠寒濕證行為表征(圖7B)。 在小鼠肺炎疾病方面,與模型組相比,給藥后小鼠肺指數顯著降低(圖7C)；小鼠肺病毒載量、胃動素水平、外周血淋巴細胞百分比、細胞因子水平得到明顯恢復(圖7D ～7G)。 以上結果表明治療寒濕疫的復方中藥對模型小鼠的各指標有不同程度的緩解作用,該模型對于評估藥物是否可以緩解hCoV-229E 寒濕疫毒襲肺證具有一定可靠性。

圖7 兩劑量的復方中藥對病證結合小鼠各評價指標的影響()Note. A, Average food and water intake of each group from the 7th to 8th day. B,Appearance and behavior scores determined at the 8th day(n=8). C,Lung index of each group (n=8). D, RT-PCR of hCoV-229E in lung tissue (n=6). E, Level of gastrin and motilin in mice serum (n=8). F, Percentage of T and B lymphocytes in peripheral blood(n=8). G,Level of inflammatory cytokines in lung tissue homogenate(n=6),high and low represent clinical double and equal dose, respectively. Compared with normal group,*P＜0.05,**P＜0.01. Compared with model group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.Figure 7 Effect of compound TCM on the disease-syndrome combination model

3 討論

中醫藥在病毒性肺炎的治療中有著豐富經驗和積極的療效,然而,大多數藥物缺乏動物實驗數據支持。 其中的主要原因是缺乏相應的動物模型,因此,構建符合中醫證候、適用于中醫藥藥效評價的動物模型迫在眉睫。

在病毒性肺炎的治療中,西藥研發主要針對病毒本身,主要通過抑制病毒的糖基化修飾以及病毒核酸,從病毒增殖周期中的吸附、穿入、復制等環節發揮抗病毒作用[17-18]。 中醫藥治療病毒性肺炎并不針對病毒本身,而是強調根據疾病證候特點辨證論治,更多關注機體整體狀態的調節,其突出特點是非特異性抗病毒、調節機體免疫功能、減輕炎性病理損傷的作用[19-20]。 因此,用動物模型從中醫證型外觀行為、一般狀態,以及藥理學、病理學、生理生化指標、免疫細胞比例等多方面對病毒性肺炎的臨床表現進行模擬,更有利于中藥抗病毒性肺炎的藥效評價。 本研究中,我們建立了hCoV-229E 寒濕疫毒襲肺證病證結合模型,發現模型小鼠在中醫寒濕證以及肺炎疾病方面與臨床表現具有一致性。

病毒感染呼吸道后,在氣候和環境的作用下,可出現以寒、濕為主的證候特征[9-10,13]。 在中醫寒濕證表現方面,模型小鼠在造模第4 天出現毛發油膩、大便粘稠等,為寒濕的早期證候；從造模第6 天開始,小鼠出現扎堆不動、攝食和飲水量減少,模型小鼠血清胃動素升高、胃泌素降低,這些表型均符合文獻報道中寒濕證動物模型的特征[15,21]。 在臨床上,寒濕疫毒襲肺證表現為乏力、惡寒、納呆、惡心、大便粘膩,本模型的中醫證候表現與臨床疾病一致[13]。

在肺炎疾病表現以及現代醫學檢測指標方面,模型小鼠出現肺組織水腫、肺泡結構破壞、炎性細胞浸潤等組織病理學改變,以及肺部陰影等影像學改變,與臨床中的肺炎的病理學和影像學表現一致。 小鼠肺組織中的病毒核酸陽性,將模型小鼠肺組織勻漿上清接種至MRC-5 細胞可造成細胞病變,說明模型小鼠肺組織中存在活病毒,符合病毒性肺炎的病原學表現。 模型小鼠 IL-6、IL-10、TNF-α 顯著升高,IFN-γ 有升高趨勢,與冠狀病毒感染的肺炎表現一致[22-23]。 模型小鼠外周血淋巴細胞百分比減少可能與淋巴細胞被招募至感染部位并發生活化后凋亡有關[24-25],與臨床上病毒性肺炎造成外周血淋巴細胞降低的現象一致[26-27]。

此外,與正常組相比,寒濕組小鼠也出現了一定程度的肺指數升高、肺組織炎性細胞浸潤、淋巴細胞百分比降低、IL-6 水平升高趨勢,提示單純的寒濕刺激也可引起肺部炎癥以及免疫功能減弱。

寒濕疫方包括麻黃、石膏、苦杏仁、羌活、葶藶子、貫眾、地龍、徐長卿、藿香、佩蘭、蒼術、茯苓、白術、焦三仙、厚樸、焦檳榔、煨草果、生姜,能夠發揮散寒、勝濕、化濕、燥濕、利濕、宣肺解表的作用,從而治療呼吸道相關癥狀,調節脾胃相關證候[13,28],與寒濕疫毒襲肺證相適應。 用該復方對模型小鼠進行驗證性給藥治療后,不僅中醫證候相關的行為表征評分以及攝食飲水量得到明顯改善,肺指數、病毒載量、血清胃腸激素及淋巴細胞比例、肺組織炎性因子水平也得到了明顯恢復,說明該模型在寒濕疫毒襲肺證藥效評價中具有一定的可靠性,并體現了中醫藥整體調節的作用特點。

綜上,本研究顯示,模型小鼠能夠模擬寒濕疫毒襲肺證的臨床變化,包括外觀和行為表征、攝食和飲水量、肺部影像學和病理學變化、肺部炎性細胞因子水平和外周血淋巴細胞百分比等,在藥效評價中具有可靠性,為治療具有該證候的病毒性肺炎藥物的應急篩選或日常研究,提供了一種可能的評價模型。