基于文獻分析的中醫藥動物模型評價方法介紹

苗明三彭孟凡劉思哲張媛鑫劉思琪石 琪羅茂麗

(河南中醫藥大學藥學院,鄭州 450046)

動物模型通過實驗動物,模擬醫學、生命科學等科學研究,是醫藥生物技術和健康產品研發中應用的與人類疾病、功能紊亂發生機制和臨床表現高度相似的生物樣本。 動物模型是我國醫療健康與生物科技產業中不可替代的核心生物資源,在疾病預防、藥物篩選、毒副作用探究與規避、發病機制解析等方面具有重要作用。 近年來,已建立多種動物模型用于相應疾病的研究,并廣泛應用于中醫藥領域。 現今,用于中醫藥研究的動物模型基本有3 種,即中醫證候動物模型、現代醫學動物模型、病證結合動物模型3 大類。 又有學者將用于中醫藥研究的動物模型總結為“基于現代醫學理論復制的病理模型”、“傳統病因動物模型”和“在現代醫學理論疾病模型基礎上根據中醫藥理論施加中醫的干預因素復制的證候模型”3 大類[1]。 動物模型構建成功與否影響中藥藥效和作用特點的評價,不少文獻也有對動物模型評價方法進行探討。 如崔寧等[2]將中醫藥動物模型評價方法總結為以兩獨立樣本t檢驗、非參數檢驗為主的單因素方差分析和以因子分析為主的多元統計分析方法兩種,任珍等[3]將中醫藥動物模型評價方法大致分為單純“證”的評價方法(四診表征)、中醫“證”結合西醫指標、以藥(方)測證、基于“組學”技術和基于中西醫病癥特點5 種等。 但由于中醫藥動物模型的特殊性,單一的動物模型評價方法難以全面反映模型動物的中醫證候特點,體現中醫“辨證論治”的獨特優勢。 有必要對中醫藥動物模型評價方法進行系統總結,尋找適合中醫藥研究的動物模型評價體系,探討體現中醫藥特點的動物模型的構建。 本文就2010 年～2021 年期間文獻中涉及的中醫動物模型評價方法進行總結,分析其優缺點,以期促進中藥研究的科學發展。

1 數據來源

在“中國知網”數據庫高級檢索界面,設置主題為“動物模型”并且含有“評價”或“分析”,時間為2010.01～2021.10,進行檢索。 初次檢索,共得到文獻2206 篇,經篩選,納入符合標準文獻1090 篇。

納入標準:選用動物實驗研究的全部文獻；具體描述單個動物模型的部分綜述。 排除標準:文中出現多個動物模型的綜述；資料不齊全的文獻；會議性論文；碩士、博士相關學位論文。

2 文獻分析

2.1 動物模型評價涉及的疾病類型分析

對納入符合標準的1090 篇文獻中涉及的動物模型和疾病類型進行分析,經系統歸類,發現以“心腦血管疾病、骨與關節疾病、神經系統疾病和消化系統疾病”居多,涉及疾病類型頻次共計1015 次,另75 篇僅有中醫“證/癥候或證/癥型”,未有具體疾病,詳見表1。

表1 文獻中疾病類型總結Table 1 Summary of disease types in the literature

由表2 知:頻次大于50 的動物模型依次為骨與關節、心腦血管、神經系統、消化系統、內分泌系統、呼吸系統和腫瘤。 上述現象的可能原因有:(1)研究頻次較高的疾病具有較高的發病率,且發病機制和臨床表現復雜多樣,單一造模方法難以體現臨床病癥特點,有必要進行深入研究,以貼合臨床實際。 (2)研究頻次較高的疾病危害率高,或病情反復、難以根治,需要從多層次、多角度進行研究。(3)目前的治療方法效果有限,難以滿足臨床需求,或者目前尚無確切有效的治療方法,一旦患病,難以長期生存。 如隨著生活方式的改變,經濟壓力,導致體力勞動和腦力勞動力度均劇增,長期久坐、負重過大導致骨缺損、軟骨損傷、股骨頭壞死、脊髓損傷、腰椎間盤突出、頸椎病和關節損傷、關節受累等引發的骨與關節疾病逐年增多,促進實驗研究相應增多[4]；心腦血管疾病具有較高的發病率、致殘率、死亡率和復發率,同時伴隨各類并發癥,是威脅健康的“頭號殺手”[5],因其發病率高、治愈率低且危害性大,故其相應的實驗研究也較多。

表2 動物模型評價方法Table 2 Animal model evaluation method

2.2 動物模型評價方法分析

對納入符合標準的1090 篇文獻中涉及到的動物模型評價方法進行分析,若一篇文獻中有2 種或以上不同的評價方法,則分別統計,結果共得到相應模型評價方法 8 種。 進一步分析發現,以“病理”、“疾病評價”和“病證結合”為主,3 者頻次分別為 613、586 和 349 次,見表 2。

為更好理解不同評價方法在模型中的評價特點,現對頻次＞40 的動物模型評價方法進行部分舉例分析,詳見表3。

表3 頻次＞40 的造模方法和評價方法舉例Table 3 Examples of modeling methods and evaluation methods with frequency ＞40

2.3 各類模型評價分析方法總結

“病理”評價方法:對于器質性病變,“病理”評價可作為此類疾病臨床診斷的“金指標”[24]。 病理學分析能與表觀、生化等數據互為補充,對于器質性病變動物模型研究是必不可少的。 如多囊卵巢綜合征(PCOS)臨床特征為性激素分泌失衡、不排卵或排卵障礙、月經異常、不孕,以卵巢囊性改變為臨床主要診斷依據。 評價PCOS 動物模型以卵巢組織病理觀察為主,判斷成模指標主要為早期發育小卵泡、閉鎖卵泡和囊性擴張卵泡多,顆粒細胞和黃體減少[25]；因卵巢卵泡發育障礙會導致月經紊亂,故PCOS 動物模型整體會表現出動情周期紊亂的現象；此外,卵泡發育受促性腺激素釋放激素、促性腺激素和性激素的調控,故激素類生化指標和相應受體蛋白的改變可側面反應卵巢病變程度,體現模型構建是否符合臨床表現[26]。前列腺炎臨床表現為尿頻、尿急、尿痛、排尿困難、夜尿多、骨盆區域不適或疼痛等癥狀,其動物模型可首先依據動物整體排尿情況、尿動力學(排尿閾值壓、排尿間隔和排尿最大壓)情況進行初步評價,然后結合前列腺組織病理觀察(腺體擴張、上皮細胞排列紊亂、增生情況,腔內炎性浸潤現象等)為主進行是否成模的評價；其次,因為前列腺炎會造成患者不同程度的焦慮、誘發機體炎癥反應,故常結合曠場實驗(運動時間、周邊滯留時間、抬腿次數、跨越方格總數)和炎癥因子(IL-1β、TNF-α 等)水平進行動物模型的輔助評價[27-28]。 病理評價方法能夠最大化實驗獲得的數據,減少實驗所需動物數量,符合動物福利3R(減少、替代和優化)原則[29-30]。 病理評價作為器質性病變疾病相關模型評價方法,雖一定程度能體現中醫藥動物模型的特點,但也有明顯的局限。 如中醫認為“腎主骨”,若僅以“脛骨、股骨”病理或/和脛骨力學強度及股骨骨密度作為骨質疏松癥成模與否的評價指標難以解釋“腎主骨”的中醫認識,難以解釋采用補腎中藥治療骨質疏松癥的中醫藥內涵,增加中醫“腎”的相關指標則更能貼合中醫藥的特點。綜上,采用病理評價結合中醫因素進行動物模型的評價更有利于體現中醫藥的特點。

續表3

續表3

“疾病評價”方法:“疾病評價”以臟器重量(長度)、外觀,血清、血漿、尿液、組織等中的指標變化趨勢與臨床患者的一致性為判斷依據,可以從多個發病機制和實驗角度進行動物模型評價。 血清、尿液等中的指標變化在一定程度可反應組織器官是否發生實質性病變,而減少對相應器官組織的取材進行病理鑒定,簡化診斷流程。 如以結腸長度、結腸重量、疾病活動指數評分(便血結合體重變化)、結腸組織外觀和病理學改變作為潰瘍性結腸炎疾病的評價依據[12],以血清中丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)活性升高,作為肝損傷的標志[31]。 以血清或尿液尿酸、肌酐、尿素氮的異常作為腎功能異常、腎損傷的評價依據[32]。 結合文獻知,“疾病評價”較少納入中醫相關因素。 且受限于造模因素的單一性,難以反應不同發病階段生化指標變化特點,即生化指標變化高低難以量化疾病嚴重程度。 如僅以空白為對照,以ALT、AST 作為評價肝損傷依據,但如何利用ALT、AST 偏離正常動物幅度判斷肝損傷嚴重程度(輕度、中度或重度損傷)尚無明確定論,必要時還需結合病理指標進行判斷。

“病證結合”評價方法:“病證結合”評價方法既包含證候學指標如一般情況、活動、進食、大小便、體質量等,也包含疾病指標如發病情況、血清、尿液等指標變化程度等,從多個角度說明疾病變化過程,可以反應部分疾病中醫證候變化特點,指導臨床研究。 如通過觀察食蟹猴精神狀態,活動情況,大便顏色、成形度、黏滯或燥結情況,皮膚有無濕疹瘙癢等證候學指標判斷食蟹猴脾胃濕熱證情況,通過B 超測定肝臟回聲、血管紋理,HE 觀察肝組織病理學改變,全自動生化分析儀測血清AST、ALT、TG、TC 含量觀察肝臟是否有脂肪性病變,ELISA 檢測血清腦腸肽激素GAS 和MTL,反映胃腸功能,最終判斷食蟹猴急性酒精性脂肪肝脾胃濕熱證模型是否成功。 其中,眾多學者將GAS 作為脾胃濕熱證的首選指標,將GAS 升高作為“脾胃濕熱證”的微觀證據之一[33]。 研究表明,陰虛患者交感神經-腎上腺系統功能偏高,表現為環磷酸腺苷(cAMP)升高、環磷酸鳥苷(cGMP)降低、cAMP/cGMP 比值升高,并將cAMP 水平升高、cGMP 水平降低或 cAMP/cGMP 比值升高作為腎陰虛的微觀指標。 如cAMP 水平升高、cGMP 水平降低或cAMP/cGMP 比值升高結合空腹血糖大于11.1 mmol/L 是常用的評價腎陰虛型糖尿病大鼠成模的依據[34]。 病證結合動物模型是目前能夠體現中醫藥特點的動物模型,因此,完善病證結合動物模型評價體系是中醫藥研究的發展趨勢。

“行為學評價”評價方法:行為學評價一般常用于抑郁癥、焦慮、應激狀態等動物模型的評價,在相關動物實驗中,行為學通常是研究后續機制的重要前提[35],可在一定程度反應疾病的發生,從而使模型呈現出更好的表觀效度。 如抑郁癥以情緒低落、興趣喪失、思維遲緩為臨床主要特征,實驗室研究常利用強迫游泳時間、懸尾實驗中的“行為絕望”時間,電擊逃避失敗次數,曠場實驗、糖水偏好實驗、新奇食物探索實驗等評價模型是否成功；抑郁是情緒相關疾病的一種,受大腦的調控,腦組織和血清中生化指標(單胺類神經遞質NE、DA,腦源神經營養因子BDNF,下丘腦-垂體-腎上腺軸促腎上腺皮質激素分泌激素、促腎上腺皮質激素、皮質激素等),腦組織中海馬區域小膠質細胞活化情況、p-JAK1/JAK1 和p-STAT3/STAT3 蛋白表達情況均可作為輔助評價指標[36-37]。 焦慮是一種情緒障礙性疾病,實驗室研究常用高架零迷宮(利用動物對高懸敞開臂的害怕和對新異環境的好奇特性形成矛盾沖突的行為考察動物的焦慮狀態)、曠場實驗(總路程、中央區停留時間、垂體活動次數、跨格數)、高架十字迷宮(開放臂停留時間和進入開放臂的次數)等行為學表現評價模型是否成功；此外,5-HT、DA、NE 等神經遞質的表達水平與焦慮癥的發生密切相關,因此海馬組織 5-HT、MAO、NE 的表達,血清 GABA、Glu 也常作為輔助指標用于模型和藥效的評價[38-39]。 行為學評價以動物的癥狀、行為學和體征等表觀指標評價為主,可反映中醫“望”的特點,能在一定程度體現中醫藥臨床特色；有些情況下行為學評價在模型評價中可占據主導地位。

“基因評價”評價方法:基因突變與疾病的發生密切相關,基因評價能從基因層面反應病變對機體影響,并可突出藥物對生物遺傳形狀的改變。 基因評價還表現在其存在脫靶效應上(對非目標基因序列進行識別并切割),不僅在一定程度上影響實驗動物模型的構建,還影響了其在臨床基因治療中的應用。 如以 IL-6 和 TNF-α mRNA 的變化作為大鼠體內炎癥反應的評價指標,結合肝形態、病理學改變,血清轉氨酶ALT 和AST 水平作為評價D-氨基半乳糖聯合Pam3CSK4 誘導的SD 大鼠急性肝損傷及炎癥反應的評價依據[40]；DMPK 相關基因人源化大鼠模型可以減少大鼠和人類在藥物代謝上的種屬差異,提高動物實驗的可信度[41-42]。 基因評價缺少中醫相關特色,具有一定片面性。 但是,一種疾病涉及多個基因突變,單個或幾個基因評價難以反應疾病整體性。 且基因技術評價指標相對單一、相關設備造價昂貴、操作復雜繁瑣,重復實驗的可行性較低,在實際應用中可將其作為輔助評價手段。

“基于中西醫臨床特點”評價方法:基于臨床中西醫病癥特點的評價方法,將表觀、生化和病理等指標均考慮在內,又按“主次”以及交互作用進行模型評價。 基于中西醫臨床特點評價方法,不僅納入了西醫的臨床癥狀特點,將西醫病理、疾病和基因評價方法涵蓋在內,全面反應動物模型的西醫臨床表現；還納入了中醫的證候,同時將動物的行為學表現、表觀指標等納入評價范圍,最大程度反應動物模型的證候、行為學,是目前較為全面的評價動物模型的方法之一。 在一定程度上,補充了實驗相關疾病的中醫學理論依據,為相關疾病的中藥新藥研究、成藥配伍、組方劑量提供新的方法思路,一定程度上促進了中醫的發展。 但中醫理論體系中一些特有的體征無法在動物身上進行收集和評價,且造模過程中無法完全復刻相關因素(舌象和脈象特點)[43],其次,體征收集不全造成四診信息不完善,導致臨床評價具有較大的主觀性,沒有統一的判斷模型成功標準。 現今,動物模型多數是在西醫指導下建立的,與中醫證候吻合度普遍較低,難以全面反映中醫學整體觀念,因此在構建證候動物模型的同時應對疾病的發展進行動態監測,不斷進行證候診斷,從而提高與中醫證型的匹配度[44]。

“證候學”價方法:中醫證候動物模型是探索證候發生與演變的重要載體,是中醫藥現代化研究的基本前提之一。 中醫“證”可追溯至中醫中的望聞問切,又稱“四診”,可由動物的癥狀和體征進行反映。 如徐小薈等[45]根據造模后大鼠出現“寒凝血瘀表征”——蜷縮少動、遲鈍、呼吸弱、皮毛蓬亂無光澤、耳色和舌暗紅、皮膚青紫瘀斑、大便濕爛等確定寒凝血瘀證造模成功；以氫化可的松灌胃后大鼠出現體重下降、易驚易怒、潮熱、多汗、大便干結和毛發枯燥等癥狀確定腎陰虛證造模成功[46]；以腺嘌呤灌胃后大鼠出現皮肉松弛、畏寒、弓背、豎毛、掉毛等現象,毛發枯疏無光澤,飲食減少,多尿、溏便等情況,甚至陰囊收縮,精神萎靡,遲鈍,活動少,體重下降等確定腎陽虛證造模成功[23]。 隨著證型研究的深入,中醫“證”也可由現代醫學檢測手段體現,如結合“四診”,以微觀指標血清中T 降低,FSH 和LH 升高,E2/T 和cAMP/cGMP 比例失衡作為腎陰虛或腎陽虛的評價依據[23,34]；利用基因組學發現線粒體介導的細胞凋亡信號通路系列相關基因表達下調與邪毒壅盛證小鼠有關[47],利用代謝組學發現亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸水平上調, 琥珀酸、馬尿酸水平下調可能是脾腎陽虛證的生物標志物[48]。 中醫“證”的評價以“四診”為主,并逐漸采用生化指標、組織病理、基因和蛋白等指標為輔,有一定的科學性和實用性。

“以方測證”評價方法:“以藥(方)測證”是利用藥效反應,推知病機,是現階段驗證證候模型成功與否、推測疾病模型證候屬性的重要手段。 證候是在疾病基礎上額外施加因素致原有疾病出現變化,運用“以藥(方)測證”驗證動物模型證候,可增加模型的可信度和說服力。 疾病發展伴隨證的動態變化,證與病相互存在,若不施加“證”的致病因素,在牢靠的疾病模型基礎上采用“以藥(方)測證”可進行動物模型證候的推測[49]。 如以茵陳蒿湯和六味地黃丸為參照,推測四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠模型屬于陰虛證[50]；以烏頭湯驗證風寒濕痹證模型的成功,同時以四妙丸作為反證,從反證角度證明風寒濕痹證動物模型的成功[51]。 但鑒于中藥方劑的多效應性、多成分、多靶點等特點,方與證之間并非一一對應的鎖定關系,即同一方劑可適用多種證候,同一證候的有效方劑亦有多個。 故有學者指出方-證之間可能是復雜的“一多關系”,因此從某方必然推斷出某證的邏輯思維也是不嚴謹的[52]。考慮到中藥方劑的多效性,“以藥(方)測證”缺乏其它方藥的多方對照,否定了可能存在的其它證候[53]。

3 討論

動物模型的效度評價是動物模型研究中十分重要的一項環節,目前較為權威的評價方式是依據鑒定和評價三效度進行動物模型效度評價,即從表觀、結構、預測3 方面對動物模型的效度進行分析[54]。 表觀效度指模型動物與人類之間現象學的相似性,一般包括被毛光澤度、活動度、精神狀態、體重、飲食狀況、大小便情況等癥狀和體征變化以及行為學指標。 結構效度體現在動物模型與研究疾病具有相似的原因或生物學機制,如腦內神經遞質改變、下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸系統激活等。結構效度是三效度中的理論基礎,也是動物模型建立過程中最基本、最重要的一個方面,決定了動物模型的有效性。 預測效度指對動物模型相應癥狀進行有效干預所產生的反應性,其作用一般體現在臨床藥物的篩選中[55]。 理想的動物模型應該符合上述3 個效度標準。 如徐小薈等[45]采用冰水冷凍法制備寒凝血瘀證大鼠模型:從大鼠活動度、飲水量、被毛光澤度、心率、耳廓血管顏色及舌色、大便性狀改變反應表觀效度,從大鼠炎癥因子TNF-α、IL-1β 升高等生理指標改變反應結構效度,以附子或附子配伍當歸、香附灌胃觀察治療效果反應該模型的預測效度。 郭文鶴等[56]采用復合因素造模構建氣滯血瘀型動脈粥樣硬化大鼠模型:從大鼠體型、舌象、耳廓血管顏色、活動度、進食量改變情況反應表觀效度；從大鼠血脂水平、凝血四項、升主動脈及肝組織病理學結果反應結構效度；給予辛伐他丁及通脈顆粒灌胃治療觀察治療效果反應模型的預測效度。 但目前較多的動物模型評價尚不能完全涵蓋上述3 個效度標準,如張澤丹等[12]采用高脂飼料喂養配合潮濕環境制備潰瘍性結腸炎濕熱證小鼠模型:從小鼠反應度、飲水量、肛門清潔度、大小便情況、有無粘液膿血便等反應表觀效度；從小鼠結腸長度、遠端結腸組織病理學改變、炎癥性指標 IL-6、IL-10、血清 SC、CRP 等病理學改變及生化指標方面反應結構效度。 張瀟等[16]采用復合因素造模制備心理亞健康大鼠模型:從大鼠行為學實驗(糖水偏好實驗、高架十字迷宮實驗、明暗箱實驗)及一般體征改變(精神狀態、被毛光澤度、活動度)反應表觀效度；從大鼠臟器指數反應結構效度。

各類疾病的發生發展受內外環境、飲食、情志等多因素影響,其對應的動物模型也應考慮多因素作用及與臨床證型和病癥的吻合程度。 中醫藥動物模型評價未來的重點方向應基于中醫證型及西醫疾病按照“主次”及交互作用全面考慮表觀指標、生化指標和病理指標等因素,參考目前疾病診療的現狀,并結合中醫“辨證治療”“ 標本兼治”等相關理論進行評價。 同時,可將基于臨床中西醫病癥特點的評價方法與代謝組學或“以藥(方)測證”進行結合,進一步完善評價體系。 中醫藥動物模型評價體系的完善與發展可以增加中醫藥相關理論的科學性、有效性和實用性,促進中醫藥研究現代化。