病證結合模式下肺癌實驗動物模型的研究進展

譚駿嵐易 健王飛英萬佳婧覃 麗戴愛國*

(1.湖南中醫藥大學醫學院-血管生物學與轉化醫學湖南省高校重點實驗室,長沙 410208；2.湖南中醫藥大學干細胞中藥調控與應用實驗室,長沙 410208；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院呼吸科,長沙 410021)

肺癌(lung cancer)主要包括小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),是臨床常見的呼吸系統惡性腫瘤。 據最新的全球癌癥流行病學調查顯示[1]:全球肺癌的總體發病率排所有癌癥中的第2 位,約占11.4%,而我國肺癌的發病率和死亡率仍位居所有腫瘤中的第1 位。 化療、靶向治療、手術治療、放療以及新興的免疫治療是當前現代醫學對肺癌的主要治療手段[2],但治療的有效性、復發率及藥物所產生的耐藥問題和不良反應,尤其是相當一部分患者無法承擔高昂的治療費用,使肺癌的治療仍面對較大挑戰。 中醫藥作為肺癌綜合治療中的重要組成部分,在提高肺癌晚期患者的生存期[3]及生活質量[4]、減輕放化療毒副反應[5-6]、緩解臨床癥狀[7]、調節免疫[8-9]方面發揮了重要作用。

動物模型是醫學實驗研究的重要載體。 由于當前現代醫學中的肺癌動物模型并不能較好的貼合中醫臨床辨證論治的核心特點,使得當前中醫藥治療肺癌的機制研究零散及滯后,且缺乏全面系統的深入研究[10]。 近年來,隨著既符合西醫疾病特征又具備中醫證候特點的肺癌病證結合動物模型的構建成功,并逐漸應用于中醫藥治療肺癌的機制研究,為充分揭示中醫藥治療肺癌的療效及深入了解其作用的相關機制奠定了基礎。

1 肺癌動物模型

臨床上,肺癌的發病機制較為復雜,因其高發病率與高死亡率,所以肺癌一直是腫瘤領域的研究熱點。 經過長期的研究探索,肺癌動物模型的構建技術已趨于成熟和穩定。 目前肺癌動物模型的種類較多,常用的動物也具有多樣性,常用的有裸鼠、A/J 小鼠、C57BL/6 小鼠、SD 大鼠、Wistar 大鼠、BABL/c 小鼠、轉基因鼠等。 目前肺癌動物模型中應用最多的為小鼠,因為其基因與人類的同源性高達90%以上,常被用于制備移植性肺癌模型。 其中肺癌鼠類模型如:化學誘導小鼠肺癌模型(苯并芘誘導[11-12]、香煙煙霧誘導[13-14]、N-甲基-N-硝基亞脲(MNU)誘導[15-16]、氨基甲酸乙酯誘導法[17-18]、反式-2,4-癸二烯醛(tt-DDE)誘導[19]、4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶)-1-丁酮(NNK)誘導[20])、化學誘導大鼠肺癌模型(3-甲基膽蒽(MCA)+二乙基亞硝胺(DEN)誘導[21]、二甲基苯并蒽(DMBA)誘導[22]等)、肺癌異位移植模型[23-26]、肺癌原位移植模型[27-29]、基因修飾肺癌模型[30-31]、肺癌轉移模型[32-34](見表1)。 不同肺癌動物模型的造模時間具有較大區別,化學誘導的肺癌模型和基因修飾肺癌動物模型的成瘤周期較長,而肺癌移植模型成瘤周期較短。 不同的肺癌動物模型因研究的內容不同而具有各自不同的特點,如化學誘導的大、小鼠肺癌模型常適用于腫瘤預防藥物的相關研究。 轉基因及移植性肺癌模型常用于肺癌病因學的研究。肺癌轉移模型可用于新藥研發。 總的來說,理想的肺癌模型需具備以下特點:(1)模型的構建方法簡單,可操作性強,造模周期適中,能較好的模擬肺癌病理過程。 (2)模型具有較強的可重復性和穩定性,能較好的反映人體的機能狀態,且模型構建費用適合。 目前對于肺癌動物模型的評價方法主要通過動物的癥狀、生物熒光顯像、腫瘤組織病理學及影像學的檢查來進行評價[35]。

表1 肺癌常見動物模型的構建方法Table 1 Common animal model construction method for lung cancer

2 病證結合肺癌動物模型

中醫古籍中雖沒有出現“肺癌”這一病名,但在眾多古書籍中所記載的“肺癰”、“肺積”、“息賁”與現代醫學中肺癌的臨床特點相符。 正氣不足是肺癌的主要發病機制和病因,正如《內經》云“正氣存內,邪不可干”、“邪之所湊,其氣必虛”。 當機體肺氣虧虛,邪毒可乘虛入肺,進而邪滯胸中,肺氣郁閉,宣降功能失調,氣機不暢,血行瘀滯,津液輸布失調,聚而為痰,痰凝氣滯,阻塞絡脈,久則痰瘀膠結于肺而形成肺積。 肺癌的發生發展是多個臟腑共同作用所致,病位雖在肺,與脾、腎密切相關。肺、脾、腎3 臟相互聯系、相互影響,共同參與肺癌的病理生理全過程。 總的來說,肺癌屬“本”虛“標”實,虛實夾雜性疾病,“本”虛為氣陰兩虛,“標”實為痰濁、瘀血、氣滯。 肺癌虛證以氣陰兩虛證、陰虛證為多見,實證以血瘀、氣滯、痰凝為主。 中醫藥治療肺癌療效確切,臨床上根據肺癌的病因病機特點常以“扶正祛邪”為主要治法,“扶正”以補肺益氣養陰、健脾益腎為主,“祛邪”以活血化瘀、清熱解毒、化痰散結為要[36],姜怡等[37]研究表明通過益氣養陰以扶正固表,清熱解毒標本兼顧的方法并基于此理論指導下的益氣養陰解毒方可以抑制小鼠肺癌原位移植瘤模型的腫瘤生長,并延長小鼠的生存期,其他的經典名方如具有清燥潤肺、益氣養陰功效的清燥救肺湯的臨床療效同樣顯著[38],并能通過干擾肺癌細胞的能量代謝來抑制Lewis 肺癌荷瘤小鼠腫瘤的增殖[39]。 陳曉波等[40]根據“腎為先天之本、脾為后天之本”的理論創立的脾腎顆粒,具有培補脾腎、益氣生血功效,可通過增強NK 細胞的活性、提高CD4+T 細胞數目和CD4+/CD8+比值來抑制Lewis 肺癌小鼠腫瘤的增殖。

動物模型已成為醫學研究的重要手段。 近年來,不斷有研究者在基于中醫基礎理論上建立了具有中醫特色的病證結合肺癌動物模型。 目前肺癌病證結合動物模型有4 種:氣陰兩虛證、脾氣虛證、腎虛證、氣滯血瘀證(見表2)。

表2 肺癌常用病證結合模型總結Table 2 Summary of the syndrome combination model commonly used in lung cancer

2.1 氣陰兩虛證

氣陰兩虛證是肺癌患者臨床最為常見的證型[41],通過肺癌病證結合動物模型對該證型的模擬具有廣泛的應用價值。 吳海良等[42]采用溫熱中藥給予小鼠灌胃加“刨花煙熏”與Lewis 肺癌荷瘤模型結合起來構建了肺癌氣陰兩虛病證結合模型,并通過觀察小鼠的癥狀體征, 檢測白細胞介素 1(interleukin-1,IL-1)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)水平及對腫瘤組織進行病理學檢測等方法對模型進行評價。 與對照組相比,病證結合模型組小鼠出現毛發逐漸脫落,無光澤,運動量下降,飲食減少,疲倦乏力,體重下降,氣短等氣陰兩虛癥狀,且IL-1、MDA 水平升高,病理學觀察瘤組織均呈現中低分化的腺癌特征,腫瘤細胞呈浸潤生長,壞死較少。 同時進行以方測證,采用具有益氣養陰作用的金復康口服液進行干預,發現益氣養陰中藥組的小鼠腫瘤相比較對照組明顯縮小,進一步驗證了氣陰兩虛肺癌模型的構建成功。 除此之外,后續逐漸也有學者在此模型基礎上,進行了益氣養陰中藥治療肺癌的作用機制研究[43-48]。 因此初步判斷,該造模方法具有一定的穩定性和可靠性。

2.2 脾氣虛證

脾為肺之母,“脾氣散精,上歸于肺”,所以肺癌病位雖在肺,但與脾密切相關,脾氣虛證在肺癌患者中也是十分常見[41,49]。 錢鈞等[50]采用“苦寒瀉下法+饑餓法+疲勞法”建立小鼠脾氣虛證模型,可在造模3、4 d 后陸續觀察到小鼠的脾虛癥狀,并在造模后第15 天通過血清檢測發現脾氣虛模型組小鼠血清D-木糖和胃泌素水平明顯低于對照組。 隨后將小鼠Lewis 肺癌腫瘤細胞株接種于小鼠右腋皮下構建脾氣虛肺癌模型。 該課題組的其他成員也同樣采取此方法構建脾氣虛證肺癌模型,并以此為基礎來對益氣健脾中藥如黃芪建中湯[51]、加味黃芪建中湯[52]、加味四君子湯[53]進行抗肺癌的作用機制研究。

2.3 腎虛證

肺癌乃“本虛標實”之疾病,而正氣虧虛之根本在于腎虛[54],因此腎虛所形成的機體內環境也可能是導致肺癌發生發展的重要病因。 豆萌萌等[55]采用手術去勢和Lewis 肺癌荷瘤模型結合構建肺癌腎虛病證結合模型,并動態觀察小鼠的行為表現、腫瘤生長情況,檢測雌二醇、睪酮和腫瘤組織病理等。結果發現腎虛肺癌模型小鼠出現怕光、膽小易驚,毛發干枯且光澤度降低,體重下降,活動時間減少等腎虛證候。 與假手術組相比,腎虛肺癌模型組小鼠的腫瘤增長速度明顯增快、腫瘤體積明顯增大,血清雌二醇、睪酮明顯下降,肺內轉移率升高和肺轉移結節數量增多,結果表明此模型是可行的,并且干擾因素較少,使模型的可操作性和可控性較強。

2.4 氣滯血瘀證

吸煙、環境污染等可導致肺失宣降,氣機失常,血行瘀滯,瘀毒氣血膠結導致肺癌的發生[56],所以氣滯血瘀證也是肺癌患者主要證型之一。 彭召云等[57]采用“腎上腺素+束縛法”與Lewis 肺癌荷瘤模型結合構建了肺癌氣滯血瘀病證結合模型,動態觀察小鼠的行為表現、并通過檢測小鼠的瘤體體積和重量來進行評價。 結果發現氣滯血瘀肺癌模型組小鼠出現聚堆、易激惹、形體消瘦,進食量和活動量減少,口周、爪甲、肛周及耳緣出現散在脈絡瘀血等與臨床證候類似的氣滯血瘀證候表現,與對照組相比,氣滯血瘀肺癌模型組小鼠的腫瘤體積增大,血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達升高,該模型在一定程度上與臨床的發病特點相符合,具備可行性。

3 討論和展望

病證結合動物模型是病證結合藥理學研究體系中的關鍵一環,也是中醫藥現代化研究中的重要組成部分。

3.1 病證結合肺癌動物模型的關鍵問題

肺癌病證結合動物模型在當前已有的疾病造模的基礎上雖取得了一定的研究進展與成績,但同時也存在較多的問題與爭議。 (1)造模思路單一,均采用“先證后病”的造模方法。 目前肺癌的病證結合動物模型基本都是在先根據中醫的病因建立證候模型,然后再通過皮下注射LEWIS 肺癌細胞細胞復制肺癌疾病模型。 該方法可能存在人為所施加的干預因素對疾病模型造成改變,且病與證二者相互影響并非獨立,增加了干擾因素從而降低了模型的穩定性和準確性。 “先證后病”的復合造模方法與中醫臨床的病證結合存在偏差。 臨床上辨證常通過“望、聞、問、切”四診合參全面收集患者的診療信息,而在肺癌病證結合動物模型中,研究者大多只通過對動物的簡單觀察或進行一些相關檢測來收集證候信息,因而無法對肺癌臨床證型進行客觀的復制。 此外,“先證后病”的造模方法無法闡明不同肺癌病理類型與證型之間的關聯性。 (2)缺乏客觀、統一的模型評價標準。 在肺癌病證結合動物模型中,造模目前主要采用腫瘤組織病理學、血液學指標檢測等手段,對動物的證候評價主要通過觀察動物的一般行為、宏觀表征及行為學,缺乏成熟完善的證候指標評價體系。 所以,目前學術界對病證結合動物模型的認可度不高。 (3)肺癌疾病模型單一,病證結合模型應用較少。 目前報道的肺癌病證模型中肺癌的疾病模型均是采用的肺癌異位移植模型,且細胞原位移植模型等其他肺癌疾病模型未見報道。 目前報道的肺癌病證結合模型有4 種,運用較多的為氣陰兩虛證、和脾氣虛證,而“瘀血”致病理論在肺癌的發病中同樣意義重大,但目前報道較少。 此外,肺癌本質上來說是本虛標實,虛實夾雜性疾病,而目前虛證與實證相結合的復合證型模型尚未見報道。

續表2

3.2 病證結合肺癌動物模型的發展思路

在未來肺癌病證結合動物模型的研究中,筆者認為:(1)造模思路與方法上認為可以嘗試采用將病因和證因同時干預模型動物,從而達到病證同期的造模效果。 這樣更為貼合臨床上病證的演變規律,減少了干擾因素。 但同時也得注意多因素的同時干預可能會造成動物的死亡,從而降低模型構建的成功率。 同時可以引入單因素造模方法,即在不同病理類型的肺癌動物模型上動態觀察動物的行為表征以及進行相關的指標檢測等來判斷“證”的類型,這樣表現出來的“證”是疾病演變過程中自然的證候表現,符合中醫臨床“證”的概念,同時也能觀察到不同病理類型的肺癌模型所表現出來的證的異同,并能在一定程度上能揭示肺癌不同證型與病理類型的關系。 (2)動物的物種存在差異,造模因素繁雜各異,不同證型之間界定存在分歧等問題,可借助臨床指南的制定思路對動物的類別的選擇及不同證型的干預手段進行標準化建設去實現肺癌病證結合動物模型的“病-證-癥”統一。 (3)在模型評價方面,可以借助現代的系統生物學技術。系統生物學的“整合”思想與中醫學的整體觀念相切合,且彌補了傳統四診方法的不足與局限[58]。 當肺癌病證結合模型建立后,一方面收集小鼠的行為學表現特征,另一方面利用代謝組學、蛋白質組學、基因組學技術篩選模型動物不同證候的特異性生物標記物從而將中醫的證候指標進行客觀的量化,并可以此為藥物靶點用以檢驗方藥的有效性。 同時,“以方測證”反向驗證評價肺癌模型缺乏針對性,且方證之間的緊密性不足,所以當使用“以方測證”反向驗證法時,應當充分考慮到中藥多靶點和一方可治療對證的特點,因此需設置對照試驗來增加研究結果的特異性。

綜上所述,肺癌病證結合動物模型目前仍處于起步的摸索階段,動物模型的總體穩定性較差,且模型構建操作技術不夠成熟。 因此,必須在遵循動物模型必備的穩定性、可重復性、可行性、客觀真實性等原則條件下,不斷去優化現有的肺癌病證結合模型構建技術和方法,并借助現代分子生物學技術完善模型的評價標準,加大研發力度,提高肺癌病證模型的創新性,構建出符合中醫臨床辨證特點的高認可度的肺癌病證結合動物模型。