金釵石斛對MPTP 誘導PD 小鼠的神經保護作用及機制研究

王孟迪魏山山姜 寧Alberto Carlos Pires Dias劉新民*王 瓊*

(1.西南醫科大學附屬中醫醫院中葡中醫藥國際合作中心藥學院,四川瀘州 646000；2.中國農業科學院農產品加工研究所,北京 100193；3.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所藥理毒理研究中心,北京 100193；4.葡萄牙米尼奧大學分子和環境生物學中心生物系中葡食藥資源研究中心,葡萄牙布拉加, 4710-057)

帕金森病(Parkinson’s diseases, PD),又稱震顫麻痹(paralysis agitans),是一種常見的神經退行性疾病,其典型的臨床表現包括靜止性震顫、運動遲緩、姿勢失衡和步態障礙等[1]。 黒質多巴胺能神經元的變性壞死以及α-突觸核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)為主要成分的路易小體(lewy’s body,LB)的形成是PD 的特征性病理表現[2]。 目前關于PD 發病的具體分子機制尚不清楚,已有的研究認為PD與氧化應激、炎癥反應以及細胞凋亡密切相關[3-5]。至今,PD 的臨床治療仍然以藥物為主,主要包括左旋多巴、單胺氧化酶B(monoamine oxidase-B,MAOB)抑制劑、NMDA 受體阻滯劑和抗膽堿能藥物等[6]。 這類藥物可有效緩解PD 癥狀,但長期治療仍會引起諸多副作用,如姿勢不穩、自主神經功能紊亂等,嚴重危害身體健康[7]。 因此迫切需要研發安全、有效、副作用小的防治PD 藥物。

中醫藥在防治 PD 方面有著豐富的臨床經驗[8],且中藥具有多環節、多靶點的藥理特點,可為PD 治療提供新思路。 PD 在中醫學理論中,癥見頭搖、手足動搖為主者可屬“顫證”范疇[9]。 金釵石斛(Dendrobium nobileLindl,DNL)又名金釵石、扁金釵、扁黃草等,味甘、微咸、無毒,主要以新鮮或干燥莖入藥,主產于貴州、云南等地[10]。 2010 年版《中國藥典》中已明確將金釵石斛作為藥用石斛的首要來源[11]。 現代藥理研究分析,金釵石斛的主要化學成分為生物堿、多糖、氨基酸、酚類、揮發油等,尤其是生物堿和多糖在抗腫瘤、降血糖以及對神經系統疾病等方面都具有顯著的改善作用[12]。 金釵石斛提取物能有效改善小鼠抑郁模型的行為學表現,顯著提高小鼠腦內的DA 和5-HT[13],金釵石斛生物總堿可以改善脂多糖誘導大鼠海馬tau 蛋白的高度磷酸化和炎癥反應,減輕海馬周圍神經細胞的凋亡[14]；此外,段燦燦等[15]通網絡藥理分析途徑,篩選到金釵石斛活性成分47 個,作用靶點88 個,富集帕金森、阿爾茨海默癥及精神、記憶障礙等神經系統疾病,從系統層面揭示了金釵石斛治療神經系統疾病的藥效物質基礎及分子機制。 因此,金釵石斛在防治帕金森病中具有很大的潛力。

在本研究中,我們采用1-甲基-4 苯基-1,2,3,6-四氨吡啶(MPTP) 制備經典的亞急性 PD 小鼠模型,探究金釵石斛提取物對 PD 小鼠的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

66 只 8 ～ 10 周齡,體重 18 ～ 20 g,SPF 級C57BL/6J 雄性小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2021-0006]。 實驗期間喂養于中國醫學科學院藥用植物研究所SPF 級實驗動物房[SYXK(京)2017-0020],自由供給標準飼料和純凈水,保持 12 h 光照(9:00 ～21:00)和 12 h 黑暗(21:00～次日9:00)交替循環,室溫20℃～23℃,濕度(55±10)%。 動物適應環境5 d 后開始實驗。實驗過程嚴格遵守3R 原則,并遵循本所實驗動物倫理委員會相關規定(SLXD-2021052119)。

1.2 主要試劑與儀器

金釵石斛生藥購自四川瀘州合江鳳鳴,由中國醫學科學院藥用植物研究所張本剛研究員鑒定為金釵石斛。

MPTP 購自美國 Sigma 公司(規格:100 mg)；美多芭購自上海羅氏制藥有限公司(規格:0.25 g,產品批號:SH5146)；小鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6 和 IL-1β 酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒均購自上海酶聯生物公司；caspase-3、 caspase-9 和 β-Actin 抗 體 均 購 自 CST 公 司(caspase-3 產品編號:9664,caspase-9 產品編號:9509,β-Actin 產品編號:4967)；HRP 羊抗兔 IgG、HRP 羊抗鼠IgG 等二抗購自Jackson 公司。

步態計算機圖像實時檢測分析處理系統(中國醫學科學院藥用植物研究所、中國航天員科研訓練中心、北京鑫海儀技術公司聯合研制)；小鼠自主活動實時檢測分析系統(中國醫學科學院藥用植物研究所、中國航天員中心、北京康森益友科技有限公司共同研制作)；AL104 電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；高速勻漿機(上海凈信)；臺式高速冷凍離心機(湘立離心機)；全自動酶標儀(美國,BIOTEK 有限公司)；自制小鼠爬桿等。

1.3 方法

1.3.1 金釵石斛提取物的制備

稱取金釵石斛莖干粉與80%酸性乙醇按1 ∶10的料液比混合浸泡1 夜,85℃條件下回流提取3 次后合并提取液,濃縮得到浸膏,干燥、粉碎后的褐色粉末即為金釵石斛提取物。

1.3.2 帕金森小鼠模型的建立及分組

適應期結束后,將小鼠隨機分為6 組:對照組、模型組、美多芭組(112.5 mg/kg)、DNL 低劑量(100 mg/kg)組、DNL 中劑量(200 mg/kg)組和 DNL 高劑量(300 mg/kg)組,各組小鼠分籠群養,每籠4 只,每組10～12 只。 除對照組以外,各組小鼠每天在固定時間進行腹腔注射(i.p)MPTP 30 mg/kg,每天1 次,連續7 d,建立亞急性PD 模型。 對照組小鼠i.p 給予相同體積生理鹽水。 美多芭組與DNL(100、200、300 mg/kg)組造模前14 d 進行灌胃(i.g)預給藥,造模期間持續每天灌胃給藥直到取材結束,對照組和模型組灌胃予以相同體積純水。 造模完成后次日進行行為學檢測,實驗流程見圖1。

圖1 實驗流程Figure 1 Experimental procedure

1.3.3 步態分析實驗(gait analysis,GA)

步態分析實驗主要用于動物運動能力及運動協調性的評價[16]。 開始實驗前5 d,每天對小鼠進行不少于3 次訓練,以確保動物可從檢測通道的一端不間斷地跑到另一端。 正式檢測前調試軟件參數,保證小鼠足印在采集圖像窗口中清晰可見。 檢測時,將小鼠的足部沾水,使小鼠連續通過跑臺,此時高頻攝像機記錄下步態錄像。 錄制完成的視頻通過計算機分析軟件進行分析,并統計步態指標。每只小鼠重復測量3 次,取平均值進行分析。

1.3.4 爬桿實驗

爬桿實驗主要用于模型動物運動能力評價[17]。自制一根長69 cm,直徑為1 cm 的鐵桿作為小鼠實驗爬桿,將直徑25 cm 的軟木質小球固定在爬桿頂部,爬桿上纏上醫用膠帶以防打滑。 檢測時,將每只小鼠頭朝上放置在球頂使其自動爬下,以小鼠雙前肢接觸爬桿底部平臺為爬完全長,記錄以下時間:小鼠頭向上至頭向下的時間(調頭時間),小鼠爬完桿子上半部分所需時間,小鼠爬完桿子下半部分所需時間,爬完全桿所需的總時間。 每只小鼠重復測量3 次,取平均值進行分析。

1.3.5 懸掛實驗

懸掛實驗參照Kuribara 等[18]的操作方法,準備一根離地面約36 cm 的電線,將小鼠前肢懸掛于水平電線上,評分方法如下:小鼠四爪抓住電線則記3分,用一后爪抓住電線記2 分,如果小鼠兩后爪均抓不住電線則記1 分,無法抓住而掉落記0 分。

1.3.6 空場實驗(the open-feild test, OFT)

空場實驗用于檢測小鼠的自主活動情況[19]。先將小鼠背對測試箱壁輕輕放入測試箱(30 cm×30 cm×35 cm),適應3 min 后開始檢測,計算機自動監測記錄小鼠10 min 內在測試箱中的自發活動情況,如總路程、運動時間、運動速度等指標。

1.3.7 小鼠腦組織分離

末次行為學實驗結束后,小鼠處死后迅速斷頭,于冰上取腦,分離紋狀體、皮層腦組織,-80℃條件下保存。

1.3.8 ELISA 法檢測紋狀體、皮層部位炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量

將腦組織進行冰上勻漿裂解,12000 r/min 離心30 min,收集上清。 ELISA 操作按試劑盒說明書進行。

1.3.9 Western blot 法檢測紋狀體中 caspase-3 和caspase-9 蛋白的表達

將各組腦組織加入蛋白裂解液勻漿,4℃條件下12000 r/min 離心 15 min 后,取上清液,按 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,分裝,-80℃凍存待用。 按每孔30 μg 蛋白上樣量配制樣品,加入SDSPAGE 上樣緩沖液配置最終樣品。 凝膠蛋白電泳條件:濃縮膠恒壓90 V,約20 min；分離膠恒壓120 V。轉膜條件:300 mA 恒流；0.45 μm 孔徑 PVDF 膜,轉膜時間60 min。 室溫封閉1 h 后用抗體稀釋液稀釋caspase-3 和 caspase-9 一抗(1 ∶1000),4℃水平搖床孵育過夜。 用抗體稀釋液稀釋山羊抗兔IgG(H+L)HRP(1 ∶0 ∶10),室溫孵育 1 h。 用 ECL 化學發光液進行檢測觀察,使用IPP 6.0 圖像分析軟件進行分析。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21. 0 對實驗數據進行統計分析,數據以平均數±標準差(ˉx±s)表示,圖形以GraphPad Prism 6.02 軟件制作。 組間差異的顯著性采用單因素方差分析(one-way ANOVA),P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 金釵石斛對PD 小鼠步態功能的影響

結果如表1 所示,在步寬指標中,各組之間的前肢步寬和后肢步寬沒有顯著性差異(P＞0.05)。 在推進指數和支撐時相指標中,模型組與對照組相比,左后推進指數、右前推進指數,右后推進指數、左后支撐時相、右前支撐時相、右后支撐時相等步態指標均有顯著差異(P＜0.01,P＜0.001),而左前推進指數和左前支撐時相均沒有顯著性差異(P＞0.05)。 與模型組比較,美多芭組、DNL(100、200、300 mg/kg)劑量組在左后推進指數均有明顯恢復(P＜0.001),DNL(100、200、300 mg/kg)劑量組在右前推進指數(P＜0.05,P＜0.01)和右后推進指數均有明顯恢復(P＜0.01)。 與模型組相比,美多芭組、DNL(200、300 mg/kg)劑量組在左后支撐時相和右前支撐時相中有明顯減少(P＜0.05,P＜0.01)。 與模型組相比,美多芭組在右后支撐時相中有明顯改善(P＜0.05,P＜0.01),DNL(100、200、300 mg/kg)劑量組與模型組相比有一定程度的改善趨勢但無顯著性差異(P＞0.05)。

表1 DNL 對PD 小鼠步態功能的影響(,n=10～11)Table 1 Effect of DNL on gait function in PD mice

表1 DNL 對PD 小鼠步態功能的影響(,n=10～11)Table 1 Effect of DNL on gait function in PD mice

注:與對照組相比,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001；與模型組相比,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01,＃＃＃P＜0.001。Note. Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001. Compared with model group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01,＃＃＃P＜0.001.

步態指標Gait indicators對照組Control模型組Model美多芭組Madopar金釵石斛組DNL 100 mg/kg 200 mg/kg 300 mg/kg前肢步寬(cm)Forepaw track width 1.36±0.38 1.39±0.59 1.10±0.26 1.17±0.41 1.24±0.43 1.21±0.43后肢步寬(cm)Hindpaw track width 1.65±0.68 2.47±0.66 1.50±0.42 1.76±0.31 1.92±0.52 1.62±0.45左前推進指數Lf propulsion index 0.39±0.12 0.62±0.18 0.48±0.08 0.47±0.05 0.46±0.07 0.46±0.08左后推進指數Lh propulsion index 0.50±0.06 0.73±0.06*** 0.55±0.03＃＃＃ 0.51±0.01＃＃＃ 0.53±0.01＃＃＃ 0.54±0.04＃＃＃右前推進指數Rf propulsion index 0.46±0.05 0.65±0.13** 0.50±0.04 0.46±0.04＃＃ 0.47±0.06＃ 0.46±0.05＃＃右后推進指數Rf propulsion index 0.47±0.12 0.66±0.04*** 0.56±0.03 0.52±0.07＃＃ 0.53±0.04＃＃ 0.57±0.07＃＃左前支撐時相Lf duty cycle 0.39±0.15 0.53±0.08 0.47±0.15 0.44±0.10 0.44±0.09 0.40±0.08左后支撐時相Lh duty cycle 0.45±0.08 0.55±0.05* 0.44±0.03＃＃ 0.49±0.07 0.43±0.04＃＃ 0.45±0.06＃＃右前支撐時相Rf duty cycle 0.45±0.16 0.63±0.16** 0.45±0.04＃＃ 0.46±0.07 0.40±0.07＃＃ 0.39±0.09＃＃右后支撐時相Rh duty cycle 0.49±0.13 0.66±0.13** 0.45±0.04＃＃ 0.51±0.05 0.54±0.08 0.55±0.09平均步行周期(s)Average step cycle 0.24±0.08 0.30±0.07 0.23±0.06 0.26±0.08 0.25±0.05 0.23±0.05

在平均步行周期指標中,模型組與對照組相比有上升趨勢,各給藥組與模型組相比有下降趨勢,但無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 金釵石斛對PD 小鼠爬桿時間和懸掛評分的影響

如表2 所示,在爬桿實驗中,與對照組比較,模型組的上半段時間、總時間均增加(P＜0.01,P＜0.001),掉頭時間和下半段時間無明顯變化(P＞0.05)。 與模型組相比,DNL(300 mg/kg)組的爬桿上半段時間指標下降(P＜0.01),下半段時間、掉頭時間和總時間無顯著性差異(P＞0.05)。 在懸掛評分實驗中,模型組與對照組比較,懸掛評分明顯下降(P＜0.05)。 與模型組相比,DNL(300 mg/kg)組的評分增加具有顯著性差異(P＜0.05),美多芭組、DNL(100、200 mg/kg)組評分有一定的增加趨勢但無顯著性差異(P＞0.05)。

表2 金釵石斛對PD 小鼠爬桿時間和懸掛評分的影響(,n=10～11)Table 2 Effects of DNL on climbing time and the score of the suspension test of PD mice

表2 金釵石斛對PD 小鼠爬桿時間和懸掛評分的影響(,n=10～11)Table 2 Effects of DNL on climbing time and the score of the suspension test of PD mice

注:與對照組相比,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001；與模型組相比,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01。Note. Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001. Compared with model group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.

組別Groups調頭時間(s)Turn round time上半段時間(s)First half of time下半段時間(s)Second half of time總時間(s)Total time懸掛評分Score對照組 Control 0.97±0.04 4.03±0.83 5.93±0.81 9.96±1.10 2.70±0.48模型組 Model 0.98±0.03 6.13±0.99*** 6.73±0.91 12.86±1.16** 1.70±0.48*美多芭組 Madopar 0.98±0.02 5.74±0.79 6.66±1.07 12.40±1.18 2.11±0.78金釵石斛組DNL 100 mg/kg 0.96±0.04 5.39±1.24 6.12±1.68 11.51±2.66 2.45±0.68 200 mg/kg 0.98±0.03 5.15±0.88 5.66±1.17 10.81±1.66 2.55±0.52 300 mg/kg 0.99±0.01 5.02±1.00＃ 6.63±0.70 11.66±1.42 2.63±0.67＃＃

2.3 金釵石斛對PD 小鼠空場實驗的影響

在空場實驗中,如表3 所示,與對照組相比,模型組在運動總路程、運動時間、平均速度、僵滯時間比率上均有顯著性差異(P＜0.05)。 與模型組相比,美多芭組,DNL(100、200、300 mg/mL)組各項指標均無顯著性差異(P＞0.05)。

表3 金釵石斛對PD 小鼠空場實驗的影響(,n=10～11)Table 3 Effects of DNL on the open-feild test of PD mice

表3 金釵石斛對PD 小鼠空場實驗的影響(,n=10～11)Table 3 Effects of DNL on the open-feild test of PD mice

注:與對照組相比,*P＜0.05。Note. Compared with control group,*P＜0.05.

組別Groups總路程(cm)Total distance運動時間(s)Time of movement平均速度(cm/s)Speed of movement僵滯時間比率(%)Ratio of stagnation time對照組 Control 3750.05±490.98 192.66±38.09 6.25±0.81 67.90±6.35模型組 Model 3188.43±647.56* 154.05±45.85* 5.31±1.08* 74.33±7.64*美多芭組 Madopar 3342.14±479.48 158.42±34.41 5.57±0.80 73.61±5.73金釵石斛組DNL 100 mg/kg 3172.60±494.68 150.43±37.41 5.29±0.82 74.94±6.24 200 mg/kg 3126.48±356.65 141.40±25.64 5.21±0.60 76.45±4.27 300 mg/kg 3215.28±699.36 151.42±59.79 5.36±1.17 74.78±9.97

2.4 金釵石斛對PD 小鼠腦組織炎癥因子水平的影響

通過前期的行為學實驗,我們認為DNL 各劑量中300 mg/kg 劑量效果最佳,因此僅選擇DNL(300 mg/kg)進行后續的研究。 ELISA 檢測結果如圖2所示,與對照組相比, 模型組小鼠紋狀體區炎癥因子 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平升高 (P＜0.001) 。 與模型組相比,美多芭、DNL(300 mg/kg)各指標顯著下降(P＜0.05,P＜0.01)。 在皮層區,各組間炎癥因子水平的差異無統計學意義(P＞0.05)。

圖2 金釵石斛對PD 小鼠腦組織TNF-α、IL-6、IL-β 水平的影響(,n=7)Note. A,TNF-α levels in striatum. B,TNF-α levels in cortex. C,IL-6 levels in striatum. D,IL-6 levels in cortex. E,IL-β levels in striatum. F,IL-β levels in cortex. Compared with control group,***P＜0.001. Compared with model group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.Figure 2 Effects of DNL on TNF-α,IL-6,IL-β levels in PD mice brain

2.5 金釵石斛對小鼠紋狀體中 caspase-3 和caspase-9 蛋白的表達的影響

免疫印跡結果如圖3 所示,對照組中caspase-3和caspase-9 蛋白的表達量較少,與對照組相比,模型組中caspase-3 和caspase-9 蛋白的表達量明顯增多(P＜0.001)；與模型組相比,美多芭組和 DNL(300 mg/kg)組中 caspase-3 和 caspase-9 蛋白的表達均有顯著下降(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001)。

圖3 金釵石斛對PD 小鼠紋狀體中caspase-3 和caspase-9 蛋白的表達的影響(,n=3)Note. Compared with control group,***P＜0.001. Compared with model group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01,＃＃＃P＜0.001.Figure 3 Effects of DNL on the expression of caspase-3 and caspase-9 proteins in the striatum of PD mice

3 討論

帕金森病是一種由多種環境因素、生物因素介導的慢性神經退行性疾病,在60 歲以上人群中患病率達1%[20]。 為了深入研究 PD 的病因及治療方法,研究者們根據疾病的病理特點制作了不同的動物模型,其中MPTP 模型是目前最常用的神經毒素模型之一,具有較長的研究歷史。 MPTP 能夠引起黑質致密部多巴胺能神經元的變性,氧化應激反應和線粒體功能障礙,能夠較好地模擬PD 的臨床表現和病理學特征[21]。 因此,在本研究我們采用腹腔注射給與MPTP 30 mg/kg 連續7 d 誘導的小鼠亞急性PD 模型來評價DNL 的藥效。 造模小鼠均在膜腔注射給予MPTP 后5～30 min 出現靜止性震顫、立毛、弓背、行動減緩、聚集成團等現象,與參考文獻[22]報道一致,提示腹腔注射給與MPTP 可成功建構PD 模型。

現代藥理學研究表明,金釵石斛生物堿具有顯著的神經保護作用,Li 等[23]發現金釵石斛生物堿可以顯著改善6-OHDA 誘導的PD 大鼠中腦黑質DA神經元丟失以及降低6-OHDA 誘導的原代大鼠中腦神經元-膠質細胞中促炎因子的釋放。 石斛堿是金釵石斛中含量最高的倍半萜類生物堿,具有顯著的生物活性[24],可顯著改善PD 癥狀保護DA 能神經元。 此外,研究表明金釵石斛中的有效活性成分槲皮素可保護機體免受神經毒性化學物質的侵害,并可防止神經元損傷和神經變性的進化和發展[25]。Singh 等[26]發現給予槲皮素可減輕鏈脲佐菌素(STZ)誘導的動物認知障礙。 槲皮素還可以通過激活PINK1-Parkin 線粒體吞噬通路改善6-OHDA 誘導的PD 模型的線粒體質量控制并保護DA 神經元,改善6-OHDA 處理下PC12 細胞線粒體功能障礙,降低氧化應激水平[27]。 結合種種研究證據,我們認為金釵石斛在防治PD 藥物研發方面具有較大的潛力,因此選擇金釵石斛醇提物作為干預藥物,探究其神經保護作用。

本研究選擇爬桿實驗、懸掛實驗、步態分析實驗和空場實驗來評價動物的行為學指標。 爬桿實驗和懸掛實驗是PD 動物模型公認、經典、常用的行為學檢測方法,對動物的協調性具有較好的檢測效果[18,28]。 在爬桿實驗中,小鼠在爬桿頂部調頭至爬桿上半段時,需要調整姿勢和方向,該動作能反映肢體的抓握調遣和協調能力,總時間可評估動物總體的運動速度和四肢協調性,因此常用于評價 PD小鼠的運動功能。 本實驗中發現,MPTP 模型組小鼠在爬桿上半段時間、總時間與對照組相比均有顯著延長,表明腹腔注射給與MPTP 使小鼠肢體運動協調能力受到一定程度的損害,而300 mg/kg 的DNL 對這種損傷起到了一定的恢復作用。 同樣,模型組懸掛評分顯著降低,提示小鼠肢體運動協調能力受損,DNL(300 mg/kg)同樣可以顯著恢復這種受損現象。

步態分析實驗是一種評價神經系統運動行為高度敏感的檢測方法[16],本研究采用自主研制的大小鼠步態分析系統,已在前期的課題中得到驗證[29],目前國內已有文獻報道將該系統應用于小鼠帕金森步態行為的研究[30]。 推進指數是指推進時長/支撐時長,用來描述動物肢體離地,在行走過程中足跡面積逐漸變小的過程。 該指標在一定程度上能反映動物行走時肢體肌力的情況。 在本實驗中,模型組的推進指數出現異常,提示模型動物的肢體推動能力下降,需要靠更大的肌力代償。 步行周期分為支撐相和擺動相,支撐時相指一個步行周期里,動物肢體支撐時長與步行周期的比例,步行周期的異常提示動物行走整體功能出現障礙,導致步行時間減少,肢體與地面接觸時間增加。 在本實驗中,與對照組相比,雖然模型組的步行周期沒有顯著性差異,但有增高趨勢,提示該模型已經出現步行異常,步行速度下降從而使動物各肢體支撐時長上升,美多芭和DNL(300 mg/kg)均可不同程度地改善PD 小鼠步態指標的異常。

近年來研究表明,炎癥反應參與了PD 的發生發展[31]。 MPTP 腹腔注射可使小鼠紋狀體內TNF-α[32]、IL-6[33]、IL-1β[34]等促炎因子表達量增加, 并伴有膠質細胞的增生[35]。 反應性小膠質細胞增生是PD 炎癥假說中的關鍵環節,有研究發現PD 模型小鼠黒質致密部小膠質細胞出現明顯增生,并產生了大量 TNF-ɑ 和 IL-1β,后兩者加速了 DA 神經元的變性和死亡,繼而引起了神經遞質DA 的生成的減少[36-37],因此,恢復因過度炎性反應引起的DA 神經元損傷是改善PD 的一個重要途徑。 本研究結果顯示,在 MPTP 模型組紋狀體中 TNF-α、IL-6、IL-1β水平及表達與對照組相比組顯著升高,DNL(300 mg/kg)給藥組小鼠紋狀體中的炎性因子指標相對于模型組均有所下降,說明DNL 對MPTP 引起的紋狀體神經炎癥同樣發揮抑制作用。 而在皮層區卻并未觀察到這一現象,這提示不同腦區對MPTP 可能存在不同的免疫反應。

PD 的發生發展還與神經細胞凋亡密切相關,過度的細胞凋亡會嚴重影響神經功能。 caspase 家族基因是控制凋亡的重要原件之一,當細胞凋亡途徑激活,caspase-3 蛋白磷酸化,細胞凋亡進入不可逆階段[38]。 在本實驗中,與對照相比,模型組小鼠caspase-3 和caspase-9 蛋白表達量增高,表明MPTP使小鼠腦組織的神經細胞發生凋亡；相比模型組,美多芭、DNL(300 mg/kg)給藥組小鼠caspase-3 和caspase-9 蛋白表達水平均顯著降低,提示DNL 可能是通過降低caspase-3 和 caspase-9 蛋白表達水平的途徑來抑制細胞凋亡對PD 動物模型的影響,更具體的作用機理有待我們下一步的研究。

綜上所述,金釵石斛提取物對MPTP 誘導的PD模型小鼠具有一定的神經保護作用,可緩解運動障礙,降低 TNF-α、IL-6、IL-1β、caspase-3 和 caspase-9蛋白表達水平,其作用機制可能是通過抑制炎癥反應, 減少神經細胞凋亡的途徑來實現的。