通心絡對小鼠鈣化性主動脈瓣膜病早期病變的影響研究

宗永輝李欣欣張 寧陳 云劉新燦*

(1.濮陽市油田總醫院,河南 濮陽 457000；2.河南中醫藥大學,鄭州 450000；3.河南中醫藥大學第一附屬醫院,鄭州 450000)

鈣化性主動脈瓣膜病(calcified aortic valve disease, CAVD)又稱為“退行性”主動脈瓣膜病,是目前引起主動脈狹窄的最常見原因。 由于CAVD的發生呈現出時間依賴性和被動性的鈣沉積,以往很長一段時間被認為是一種退行性病變。 隨著對瓣膜組織病理學和流行病學研究的深入,發現其是一種類似于動脈粥樣硬化的主動進展性疾病。 首先越來越多的證據顯示CAVD 具有與動脈粥樣硬化相同的病理特點:脂質在內皮下的大量堆積,炎癥細胞的浸潤,內皮功能障礙以及鈣化等；其次是在流行病學發現二者之間具有多種危險因素的重疊,包括:年齡、吸煙、高血壓、糖尿病、高脂血癥和腎功能不全等[1-2]。 這些觀察結果表明,CAVD 發病機制可能與動脈粥樣硬化的早期機制相似,同樣也有被防治的可能。 通心絡具有多效性作用,是動脈粥樣硬化疾病治療中常用的中成藥。 研究表明通心絡通過劑量依賴型作用在降血脂,抗氧化和抗炎以及調節內皮功能障礙等方面與他汀類藥物藥理作用相當[3-4]。 基于CAVD 早期發病機制與動脈粥樣硬化相似,本研究擬通過導絲損傷瓣膜內皮機制建立CAVD 動物模型[5-7],在早期階段進行中藥通心絡超微粉干預,嘗試探討通心絡對CAVD 早期階段脂質、炎癥、氧化應激等方面的影響,觀察是否能夠延緩CAVD 的進展。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取 50 只 10 周齡 SPF 級雄性 C57BL/6J 小鼠,體重25～28 g,購自鄭州市惠濟區華興實驗動物養殖場[SCXK(豫)2019-0002]。 小鼠飼養于河南中醫藥大學一附院動物實驗研究中心動物房[SYXK(豫)2017-0001],室內環境清潔,室溫恒定(22±2)℃,12 h 為明/暗周期,并隨意接受食物和飲用水。 動物實驗研究方案已經過河南中醫藥大學第一附屬醫院動物實驗中心倫理委員會的審查和批準(YFYDW2019039),實驗研究過程中對實驗鼠嚴格遵守3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

總膽固醇(TC) 含量檢測液(BC1980,Elabscience)；蘇木素伊紅(HE) 染色液(G1120,Solarbio)； 髓過氧化物酶檢測液(SEKM-0118,Elabscience)；鈣鹽染色液(改良茜素紅S 法,G3280,Solarbio)； anti-CD68 單 克 隆 抗 體 (K200071 M,Solarbio)；anti-ACTA2 單克隆抗體(K200017 M,Solarbio)；anti-OPN 單克隆抗體(ABclonal)；anti-NOS3 多克隆抗體(K009697P,Solarbio)。 通心絡超微粉劑,主要成分:人參、水蛭、全蝎、赤芍、蟬蛻、土鱉蟲、蜈蚣、檀香、降香、乳香(制)、酸棗仁(炒)、冰片,均購自以嶺藥業。

1.3 方法

1.3.1 模型建立

10～12 周齡雄性 C57BL/6J(野生型)小鼠,體重25～28 g,抽取適量1.25%阿佛丁以0.2 mL/10 g劑量麻醉；待小鼠充分麻醉后,用脫毛膏清除頸部及胸前區(主要為左側心前區)毛發,然后固定于鼠板上；持手術剪縱向剪開頸前皮膚,然后持無齒鑷子和止血鉗鈍性分離出右頸動脈,并使其充分暴露；預留2～3 根結扎線,結扎遠端頸動脈；右手持穿刺針先45°進針后平行血管向前推進一段距離,固定穿刺針外鞘后拔出針芯；將雅培直導絲(HITORQUE 0.014’’)沿穿刺鞘管在超聲引導下緩慢送入主動脈瓣膜處,前后移動50 次后再以每秒2 次的速度旋轉100 次。 結束后退出導絲立即對主動脈瓣處行多普勒超聲檢測,確定是否反流。 然后進行近段結扎,在傷口處滴灑2 滴抗生素預防感染。 假手術組模型的建立,同樣是鈍性分離右頸動脈,送入導絲但不進入主動脈瓣膜處,其余操作方法相同。

1.3.2 實驗分組和給藥

建立模型1 周后將所有動物行彩超多普勒檢測主動脈流速檢測,除假手術組(8 只)外把主動脈流速相對增加值(上下差值＜10%)相近的組成一組,再在進行隨機分配成4 組分別為:模型組(12 只)、通心絡大劑量組(10 只)、通心絡中劑量組(10 只)、通心絡小劑量組(10 只)。 根據973 項目關于通心絡藥物藥效試驗的配置和劑量規定:依據動物數量將通心絡超微粉溶于純水中配制成大中小劑量(中劑量為臨床等效劑量)分別為1.5、0.75、0.38 g/kg,每天灌胃1 次。

1.3.3 多普勒超聲心動圖檢測

M 型超聲心動圖和彩色多普勒超聲分別檢測左室心功能和主動脈瓣狹窄情況。 M 模式下在胸骨旁長軸切面測量左室射血分數。 壁厚測量采用胸骨旁長向M 型和短向M 型。 彩色多普勒模式在胸骨旁長軸和胸骨上切面對主動脈瓣峰值流速及反流進行成像,超聲探頭角度校正范圍為40°～50°。峰值流速較基線增加15%～50%定義為輕度狹窄,50%～75%定義為中度狹窄,＞75%定義為重度主動脈瓣狹窄。 整個操作過程有1 人獨自完成,減少個體間差異性；所有操作方法和檢測結果都在超聲科老師指導下完成。

1.3.4 血清指標檢測

取材后采用腹主動脈采血法收集血液,將采集血樣室溫靜置2 h,然后放入離心機以3500 r/min離心10 min 后分離血清備用,采用比色法檢測血清髓過氧化物酶(MPO)活力和總膽固醇(TC)的濃度。

1.3.5 主動脈瓣瓣葉厚度和鈣鹽沉積情況檢測

取新鮮主動脈瓣組織,10%中性福爾馬林固定,乙醇梯度脫水,石蠟包埋。 用組織切片機切3 和5 μm 超薄石蠟切片,分別進行HE 染色和茜素紅鈣鹽染色觀察主動脈瓣形態變化和鈣鹽沉積情況。

1.3.6 免疫組化檢測分析

取脫水包埋后主動脈瓣組織,切3 μm 超薄石蠟切片,免疫組化SP 法檢測各組標本中巨噬細胞,α-SMA 和OPN 陽性細胞表達情況。 采用 Image J 圖像軟件分析切片的陽性染色面積(平均光密度值表示)。

1.4 統計學方法

實驗結果采用SPSS 19.0 進行統計學分析,計量資料采用平均數±標準差(),若數據方差齊且符合正態分布,采用單因素方差分析,當數據不是正態分布或方差不相等時,采用Kruskal-Wallis 非參數檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 多普勒超聲心動圖檢測結果

通心絡灌胃6 周后對各組主動脈峰值流速進行多普勒超聲檢測。 與假手術組比較,其它各組主動脈瓣峰值流速明顯增加,其中模型組增加最為顯著；與模型組相比,經通心絡干預后主動脈瓣峰值流速明顯降低,而通心絡1.5 g/kg 組降低最多,如表1 所示。

表1 通心絡干預6 周后主動脈流速檢測值(,n=8)Table 1 Aortic flow velocity after 6 weeks of Tongxinluo intervention

表1 通心絡干預6 周后主動脈流速檢測值(,n=8)Table 1 Aortic flow velocity after 6 weeks of Tongxinluo intervention

注:與假手術組相比,*P＜0.05；與模型組相比,＃P＜0.05；與通心絡 1.5 g/kg 相比,△P＜0.05。Note. Compared with sham operation group,*P＜0.05. Compared with the model group, ＃P＜0.05. Compared with Tongxinluo 1.5 g/kg,△P＜0.05.

組別Groups假手術組Sham group模型組Model group通心絡1.5 g/kg Tongxinluo 1.5 g/kg通心絡0.75 g/kg Tongxinluo 0.75 g/kg通心絡0.38 g/kg Tongxinluo 0.38 g/kg主動脈流速(m/s)AV Peak velocity 589.77±25.90 1024.98±81.67* 788.36±48.05*＃ 848.68±54.20*＃ 949.73±32.61*＃△

2.2 血清指標檢測

通心絡超微粉灌胃6 周后,檢測各實驗組血清中總膽固醇和髓過氧化物酶的水平,結果顯示:通心絡各組血清總膽固醇含量較假手術組、模型組明顯降低(P＜0.05),表明通心絡在降低膽固醇方面效果顯著；髓過氧化物酶作為氧化應激的來源,以此檢測實驗各組氧化應激水平。 與假手術相比,其它實驗組MPO 活力明顯升高(P＜0.05),但通心絡干預各組較模型組MPO 活力顯著下降(P＜0.05),如表2 所示。

表2 血清膽固醇和髓過氧化物酶的變化(,n=8)Table 2 Changes of serum cholesterol and myeloperoxidase

表2 血清膽固醇和髓過氧化物酶的變化(,n=8)Table 2 Changes of serum cholesterol and myeloperoxidase

注:與假手術組相比,*P＜0.05；與模型組相比,＃P＜0.05；與通心絡 1.5 g/kg 相比,△P＜0.05。Note. Compared with sham operation group,*P＜0.05. Compared with the model group, ＃P＜0.05. Compared with Tongxinluo 1.5 g/kg,△P＜0.05.

組別Groups假手術組Sham group模型組Model group通心絡1.5 g/kg Tongxinluo 1.5 g/kg通心絡0.75 g/kg Tongxinluo 0.75 g/kg通心絡0.38 g/kg Tongxinluo 0.38 g/kg總膽固醇(mmol/L)TC 2.43±0.34 2.24±0.26 1.61±0.11*＃ 1.65±0.21*＃ 1.86±0.18*＃髓過氧化物酶(U/L)MPO 47.44±14.50 453.40±63.83* 116.30±28.74*＃ 166.22±29.81*＃ 208.46±35.21*＃△

2.3 各組主動脈瓣HE 和茜素紅鈣鹽染色

通過HE 和茜素紅鈣鹽染色分別觀察主動脈瓣小葉的形態變化和鈣鹽沉積情況,如圖1、表3 所示。 HE 染色結果顯示,與假手術組相比,其它實驗各組主動脈瓣小葉海綿層內部結構紊亂,有不同程度的膠原纖維增(P＜0.05),其中模型組增厚較為明顯,通心絡干預各組隨著劑量的增加,主動脈瓣增厚和分化程度逐漸減少。

表3 主動脈瓣小葉厚度比較(,n=8)Table 3 Comparison of aortic leaflet thickness

表3 主動脈瓣小葉厚度比較(,n=8)Table 3 Comparison of aortic leaflet thickness

注:與假手術組相比,*P＜0.01；與模型組相比,＃P＜0.01。Note. Compared with sham operation group,*P＜0.01. Compared with model group, ＃P＜0.01.

組別Groups假手術組Sham group模型組Model group通心絡1.5 g/kg Tongxinluo 1.5 g/kg通心絡0.75 g/kg Tongxinluo 0.75 g/kg通心絡0.38 g/kg Tongxinluo 0.38 g/kg主動脈瓣葉厚度(μm)Aortic leaflet thickness 23.55±2.11 58.24±2.40* 37.72±1.67*＃ 40.87±1.58*＃ 42.04±1.45*＃

圖1 各組主動脈瓣小葉HE 染色Figure 1 HE staining of aortic valve leaflets in each group

茜素紅鈣鹽染色結果顯示,如圖2 所示,模型組出現少量鈣鹽沉積,通心絡干預各組均未出現。

圖2 各組主動脈瓣小葉茜素紅鈣鹽染色Figure 2 Alizarin red calcium salt staining of aortic leaflets in each group

2.4 免疫組化檢測分析

CD68 抗體主要用于檢測瓣膜病變部位炎性巨噬細胞浸潤情況；如圖3 所示,巨噬細胞主要分布在主動脈瓣根部和病變部位瓣膜內皮細胞下；與假手術組比,各實驗組巨噬細胞陽性率均增加,模型組最為顯著；與模型組相比,通心絡干預各組其陽性細胞占比均明顯減少；通心絡干預各組隨著劑量增加,瓣膜內巨噬細胞陽性率逐漸減少,但差異不顯著。

圖3 主動脈瓣內巨噬細胞免疫組化DAB 染色Note. Compared with sham operation group,*P＜0.05. Compared with model group, ＃P＜0.05.Figure 3 Immunohistochemical DAB staining of macrophages in aortic valve

ACTA2 單克隆抗體標記的平滑肌肌動蛋白(α-SMA)主要檢測瓣膜肌成纖維的分布；如圖4 所示,假手術組中幾乎未表達α-SMA,模型組中陽性細胞分布向內皮下層延伸,并且陽性細胞分布面積均高于其他各組；通心絡干預各組陽性細胞分布面積較模型組減少但高于假手術組。

圖4 主動脈瓣內α-SMA 免疫組化DAB 染色Note. Compared with sham operation group,*P＜0.01. Compared with model group,＃P＜0.01.Figure 4 Immunohistochemical DAB staining of α-SMA in aortic valve

骨橋蛋白(OPN)抗體染色陽性細胞主要分布在瓣膜病變部位,在所有各組中模型組陽性率最高,通心絡干預各組有少量陽性細胞,但明顯少于模型組,假手術組僅有極少量陽性細胞,如圖5所示。

圖5 主動脈瓣內OPN 免疫組化DAB 染色Note. Compared with sham operation group,*P＜0.01. Compared with model group,＃P＜0.01.Figure 5 Immunohistochemical DAB staining of OPN in aortic valve

3 討論

CAVD 是一個慢性演變過程,涉及遺傳易感性、內皮切應力、慢性炎癥、脂質沉積和瓣膜鈣化,并以進行性纖維化組織重塑和礦化為特征[8-9]。 在初期階段由于機械和(振蕩)剪切應力會誘發瓣膜內皮細胞層(VEC)的內皮功能障礙,從而導致脂蛋白在內皮下的沉積并引起炎癥細胞浸潤[10-11]。 基于CAVD 與動脈硬化性疾病早期發病機制的相似性,他汀類藥物也被應用于CAVD 中,非常可惜的是在多個大型臨床研究中被證實是不能減緩鈣化性瓣膜病的進展[12-13],原因可能是干預時已經進展到鈣化不可逆階段。 近年來有研究發現在CAVD 的早期進行他汀藥物的干預能夠延緩疾病的進程[14],而且在疾病早期階段能夠有效延緩病程進展這一假設在其他動物實驗已經被驗證。 本實驗研究通過超聲引導下導絲損傷瓣膜內皮細胞,并在早期階段使用通心絡藥物干預CAVD 動物模型發現:通心絡能夠通過抑制炎性巨噬細胞的產生,減少超氧化物的氧化應激以及抑制瓣膜骨化的信號通路中主要蛋白的表達；實驗證實通心絡能夠在早期對CAVD的鈣化具有延緩作用。

通心絡作為心血管疾病中最常用的中成藥已在臨床實踐中用于治療心絞痛患者十多年了[15],其主要成分包括人參、赤芍、冰片和酸棗仁等。 正是因為由多味草藥合制而成,導致提取物中多種化合物的累積或協同作用,這也是為什么通心絡具有包括改進內皮功能、降脂、抗氧化、血管舒張、抗血栓、抗發炎、抗凋亡和增強血管生成等多效性作用的原因[16-17]。 例如,通心絡藥物中的人參,其主要成分為人參皂甙。 據報道,人參皂苷Rb1 可有效阻斷高半胱氨酸誘導的豬冠狀動脈內皮功能障礙,超氧陰離子產生和內皮一氧化氮合酶下調[18]；人參皂甙Rb2 能夠降低經高脂培養基中3T3-L1 脂肪細胞的TC 和TG 的水平[19]。 研究發現,赤芍同樣具有抗氧化、血管舒張、抗血小板、降脂和抗炎能力[20-21]。 此外,酸棗仁也具有提升免疫力和降脂的作用。

目前研究表明瓣膜內皮細胞的破壞是CAVD形成的首要因素[22-23]。 同動脈粥樣硬化一樣,CAVD 的觸發事件是機械應力增加和剪切應力減少引起的內皮損傷。 剪應力改變后的內皮損傷允許脂質的浸潤,尤其是LDL 和脂蛋白-a(Lp-a),開始將炎癥細胞招募到瓣膜中。 在手術切除的鈣化主動脈瓣中發現炎性浸潤主要是有巨噬細胞、肥大細胞、CD4+T 細胞和 CD8+T 細胞組成[24]。 這些炎癥是先天免疫的主要反應,發生在內皮細胞受損后,伴隨著炎癥的激活和脂質沉積。 先天性免疫反應及其它細胞和體液反應都牽涉到這一過程。 作為對外來生物體、細胞殘骸或物理刺激物引起的損傷的反應,先天免疫系統代表了對外部或內部觸發的第一反應,并啟動了組織再生的過程。 一旦炎癥過程被觸發,它將沿著一定的過程進行,直到炎癥刺激被根除,愈合機制可以開始。 然而,如果炎癥源不能被消除,炎癥將會進展,隨著時間的推移強度不同[25]。 CAVD 中的先天性免疫反應最初是由幾種氧化類脂物質通過toll 樣受體和NF-κB 途徑引起的。 VICs 表達TLRs,已知在炎癥和抗原特異性適應性免疫反應的啟動中起關鍵作用。 TLRs 可以被幾種脂類物質激活,特別是ox-LDL,信號通過特定適配分子的補充進而激活轉錄因子NF-κB[26]。 通過這種方式TLRs 信號通過核因子NF-κB 途徑調整炎癥,對維持組織內環境穩定至關重要。 通心絡不僅能夠下調TLR4、NF-κB 的表達,而且可以通過抑制血管損傷引起的巨噬細胞浸潤,分泌炎癥因子TNF-α 下調轉錄因子 KLF5 而改善新生內膜的形成,從而起到保護內皮細胞的作用[27],這與我們的實驗結果相一致。

我們的實驗研究和其他人一樣存在不足之處。首先,由于對導絲損傷瓣膜的力度無法做到嚴格的一致性,導致對瓣膜損傷程度的差異性；對此我們在建立模型時此部分操作都有同一人完成,同時根據術后瓣膜流速的變化進行區組隨機分組以保證實驗各組間的可比性。 第二,由于小鼠瓣膜組織較小并且在該實驗中樣本量較少,我們沒有對主要蛋白進行蛋白質定量分析的蛋白質印跡分析。 第三,盡管已經驗證了通心絡的降脂,抗炎,抗氧化作用對早期CAVD 的影響,但這些作用背后的詳細分子機制仍需進一步大樣本量驗證。