麻黃堿介導TSLP/OX40L通路調節變應性鼻炎大鼠Th2型免疫反應的作用研究

楊玲 劉杰 李江平 李鶴

（襄陽市中心醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，襄陽 441021）

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是一種Ⅰ型超敏反應，源于特定過敏原的致敏作用，如家用塵螨、寵物和花粉［1-2］。免疫球蛋白E（IgE）介導的變應性鼻炎是一種以打噴嚏、鼻塞、鼻癢和鼻漏為特征的慢性疾病。這些癥狀是由IgE刺激的肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和T淋巴細胞釋放的各種炎癥介質引起［3］。現有幾種藥物用于治療變應性鼻炎，如抗組胺藥、皮質類固醇、抗白三烯和鼻減充血劑。然而，在變應性鼻炎中長期使用這些藥物可能會有不良副作用，且這些藥物對部分患者的治療效果并不理想。麻黃堿（Ephedrine）是一種存在于多種麻黃屬植物中的生物堿，同時也是經典的α和β腎上腺素能激動劑，具有刺激中樞神經系統、升高血壓和擴張支氣管的作用［4］。目前，許多研究報道麻黃聯合其他藥物在變應性鼻炎中的治療效果［5-6］。也有學者發現麻黃堿與丙酸氟替卡松聯合使用對早期中重度持續變應性鼻炎具有較好療效［7］，然而，麻黃堿治療變應性鼻炎的具體分子機制尚不明確。輔助性T細胞2（Th2）及其釋放的細胞因子如IL-4、IL-13等與變應性鼻炎的炎癥反應密切相關［8］。胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP）/OX40L與Th2細胞免疫應答密切相關，TSLP/OX40L是啟動和維持變應性鼻炎中Th2型免疫應答的重要信號通路［9-10］。本研究的目的是考察麻黃堿對卵白蛋白（OVA）誘導的變應性鼻炎大鼠模型中Th2型免疫反應及TSLP/OX40L通路的影響，從而進一步揭示麻黃堿治療變應性鼻炎的藥理學作用。

1 材料與方法

1.1 材料從北京維通利華實驗動物技術有限公司購買雌性SD大鼠40只，體質量200~250 g。大鼠在12 h光-12 h暗照明、室溫（23±2）℃、濕度（45±5）%的環境中飼養，自由獲取食物和水。

卵白蛋白（OVA）購自美國Sigma-Aldrich公司；麻黃堿購自吉林省輝南輝發制藥股份有限公司，國藥準字H22021712；總IgE、IL-4和IL-13 ELISA試劑盒購自上海心語生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；PrimeScript RT試劑盒、SYBR Prime Script RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；BCA試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。本研究所有抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、建模及藥物治療將雌性SD大鼠隨機分為4組，對照組（Control）、模型組（Model）、麻黃 堿組（Ephedrine，10 mg/kg）和 氯雷 他 定 組（Loratadine，2 mg/kg），每組10只。除對照組外，其余組大鼠均建立OVA誘導的變應性鼻炎大鼠模型。將0.3 mg OVA和30 mg氫氧化鋁溶解于生理鹽水中，每隔1 d腹腔注射1次，連續14 d。致敏后第15~21天，每天激發1次，每鼻孔滴注10%OVA溶液20 μl（溶于1 ml生理鹽水中），連續7 d。致敏后第15~21天，麻黃堿組大鼠每天灌胃10 mg/kg麻黃堿，氯雷他定組大鼠每天灌胃2 mg/kg氯雷他定，均連續給藥7 d。

1.2.2 鼻部癥狀評分鼻部評分在研究第22天進行。大鼠單獨放在籠子里，在經過10 min的適應期后，觀察10 min內大鼠打噴嚏、撓鼻和流鼻涕［11］。每分鐘打噴嚏次數：0分無、1分1~2次、2分3~5次、3分>6次；每分鐘撓鼻次數：0分無、1分1~2次、2分3~5次、3分>6次；流鼻涕：0分 無、1分 單鼻孔、2分雙鼻孔、3分涕流滿面。總分超過5分即為造模成功。

1.2.3 ELISA分析所有大鼠在40 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg賽拉嗪麻醉下頸椎脫位處死。眼底靜脈叢取血，3 000 r/min離心10 min。分離血清，并將其冷藏于-80℃。使用相應的ELISA試劑盒檢測血清總IgE、IL-4和IL-13水平。IgE以KU/L表 示、IL-4以pg/ml表示、IL-13以ng/L表示。

1.2.4 組織病理學分析將大鼠處死后，剪下鼻部并用4%多聚甲醛固定48 h，然后石蠟包埋，切成4 μm切片。按照制造商說明，對切片進行HE染色。

1.2.5 qRT-PCR分析用TRIzol試劑從大鼠鼻黏膜組織中提取總mRNA，PrimeScript RT試劑盒逆轉錄合成cDNA。使用SYBR Prime Script RT-PCR試劑盒在Applied Biosystems 7900HT熒光定量PCR儀上進行qRT-PCR分析。引物序列如下，TSLP：5'-CTCCGGTATAGCACAATTC-3'（正向）和5'-TGCATACCGAGTCATAAG-3'（反向）；OX40L：5'-CCCATGTCTCGGCACCTATTAA-3'（正向），5'-ATGTCTGAATGAATGTCGGGGA-3'（反向）；β-actin：5'-CTGAAGAGATCTACGGGA-3'（正向），5'-GCATTGCTGC?TACCGTAACTGT-3'（反向）。反應條件：95℃3 min；95℃10 s、60℃30 s、72℃40 s，40個 循 環；72℃10 min。將TSLP和OX40L的mRNA水平標準化為β-actin，通過2-ΔΔCt方法計算mRNA相對表達量。

1.2.6 Western blot將大鼠鼻黏膜組織剪碎、研磨，使用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解組織，12 000 g離心10 min。BCA試劑盒測定蛋白濃度。10%SDS-PAGE電泳分離蛋白（20 μg），并轉移到聚偏氟乙烯膜上。使用含5%脫脂乳的TBST封閉膜2 h，將膜與TSLP（1∶1 000稀釋）、OX40L（1∶1 000稀釋）和β-actin（1∶2 000稀釋）一抗4℃孵育過夜，隨后與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶1 000稀釋）室溫孵育1 h。使用ECL化學發光試劑盒進行顯影。

1.2.7 免疫組織化學分析鼻黏膜組織切片用PBS洗滌后，在3%H2O2中孵育10 min阻斷內源性過氧化物酶活性。在500 W微波下用抗原修復液處理2次，每次5 min，將切片冷卻。用PBS洗滌后，切片與PBS稀釋的環氧合酶2（COX2）（1∶1 000稀釋）一抗4℃過夜孵育。PBS洗滌后，將切片與辣根過氧化物酶（HRP）標記的IgG二抗（1∶1 000稀釋）室溫避光孵育1 h，PBS洗滌。然后DAB染色3~10 min，蘇木精復染。每張切片隨機選擇6個高倍視野（200倍），計數100個視野中的細胞，并計算陽性細胞率。陽性細胞率=陽性細胞占細胞總數的百分比。

1.3 統計學處理SPSS21.0軟件進行統計分析。正態分布檢驗后，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和Tukey事后檢驗對正態分布的數據進行分析。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 麻黃堿對變應性鼻炎大鼠鼻部癥狀的影響各組大鼠的鼻部癥狀評分如圖1所示，模型組大鼠的鼻部癥狀評分顯著高于對照組（P<0.05），表示建模成功。與模型組相比，麻黃堿組和氯雷他定組的鼻部癥狀評分顯著降低（P<0.05），說明麻黃堿和氯雷他定均能明顯減輕變應性鼻炎大鼠的鼻部癥狀。

圖1 各組大鼠的鼻部癥狀評分Fig.1 Scores of nasal symptoms of rats in each group

2.2 麻黃堿對變應性鼻炎大鼠鼻黏膜組織病變的影響HE染色顯示（圖2），對照組大鼠鼻黏膜和黏膜下層組織結構正常，模型組大鼠出現鼻腔杯狀細胞增生，鼻上皮纖毛脫屑，嗜酸性細胞浸潤嚴重，鼻腔內有壞死的嗜酸性腫塊。在黏膜下層觀察到嚴重水腫、血管擴張和充血。麻黃堿組和氯雷他定組輕度杯狀細胞增生，黏膜下層輕度水腫，血管輕度擴張。

圖2 各組大鼠鼻腔組織的HE染色（×200）Fig.2 HE staining of rat nasal cavity tissues in each group（×200）

COX2是炎癥反應的重要組分和標志物，本研究通過免疫組化染色檢測了各組大鼠鼻黏膜組織中COX2的表達，如圖3所示，模型組大鼠鼻黏膜組織中COX2陽性細胞率顯著高于對照組（P<0.05）。與模型組相比，麻黃堿組和氯雷他定組大鼠鼻黏膜組織中COX2陽性細胞率顯著降低（P<0.05）。結果說明麻黃堿和氯雷他定均能明顯減輕變應性鼻炎大鼠的鼻黏膜組織病變。

圖3 各組大鼠鼻黏膜組織中COX2的免疫組織化學染色（×200）Fig.3 Immunohistochemical staining of COX2 in nasal mucosa tissue of rats in each group（×200）

2.3 麻黃堿對變應性鼻炎大鼠Th2型免疫反應的影響由于Th2細胞免疫反應是通過釋放細胞因子如IL-4、IL-13等進行抗原呈遞的，并且IL-4和IL-13通過誘導產生IgE而導致過敏性炎癥，因此，IL-4和IL-13的異常可直接反映Th2細胞免疫的激活與否。因此，本研究通過ELISA分析各組大鼠血清中IgE水平以及Th2型細胞因子IL-4和IL-13的水平，從而考察麻黃堿對變應性鼻炎大鼠Th2型免疫的影響。如圖4所示，模型組大鼠血清中IgE、IL-4和IL-13水平顯著高于對照組（P<0.05）。與模型組相比，麻黃堿組和氯雷他定組大鼠血清中IgE、IL-4和IL-13水平顯著降低（P<0.05）。結果說明麻黃堿和氯雷他定均能明顯抑制變應性鼻炎大鼠Th2型免疫反應。

圖4 各組大鼠血清中IgE、IL-4和IL-13水平Fig.4 Levels of IgE，IL-4 and IL-13 in serum of rats in each group

2.4 麻黃堿對變應性鼻炎大鼠鼻黏膜組織TSLP/OX40L通路的影響通過qRT-PCR和Western blot分析各組大鼠鼻黏膜組織中TSLP和OX40L的mRNA和蛋白表達水平，如圖5和圖6所示，模型組大鼠鼻黏膜組織中TSLP和OX40L的mRNA和蛋白表達水平均顯著高于對照組（P<0.05）。與模型組相比，麻黃堿組和氯雷他定組大鼠鼻黏膜組織中TSLP和OX40L的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05）。結果說明麻黃堿和氯雷他定均抑制了變應性鼻炎大鼠鼻黏膜組織中TSLP/OX40L通路的活化。

圖5 各組大鼠鼻黏膜組織中TSLP和OX40L的mRNA水平Fig.5 TSLP and OX40L mRNA levels in nasal mucosa tissues of rats in each group

圖6 各組大鼠鼻黏膜組織中TSLP和OX40L蛋白水平Fig.6 TSLP and OX40L protein levels in nasal mucosa tissues of rats in each group

3 討論

據報道，麻黃堿通過PI3K/Akt途徑增加抗炎細胞因子IL-10和降低促炎細胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的表達，從而控制炎癥反應［4］。此外，在脂多糖（LPS）誘導的內毒素休克小鼠模型中，麻黃堿通過平衡TLR4信號中促炎細胞因子和抗炎細胞因子的產生來促進免疫穩態并發揮抗炎作用［12］。目前，許多研究報道麻黃聯合其他藥物在變應性鼻炎中的治療效果［5-7］，然而，麻黃堿治療變應性鼻炎的具體分子機制尚不明確。

變應性鼻炎發展過程中，炎癥改變會導致鼻涕、瘙癢和打噴嚏等鼻部癥狀。隨后是中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、T和B淋巴細胞遷移到鼻黏膜的后期階段［13］。在這種細胞流動中，嗜酸性粒細胞尤其會增加活性氧自由基（ROS）的產生，從而增加鼻黏膜的通透性并促進黏液的產生，降低上皮纖毛的功能，促進黏附分子的表達和炎癥介質的釋放。另外，COX2是花生四烯酸生成二十烷酸的原因，也是炎癥反應的重要組成部分和標志物［14］。本研究顯示，麻黃堿顯著減少變應性鼻炎大鼠的鼻部癥狀，HE染色證實麻黃堿治療后大鼠鼻黏膜內的炎癥細胞浸潤明顯減輕，免疫組織化學染色顯示麻黃堿抑制了鼻黏膜組中COX2的表達，并且麻黃堿的治療效果與氯雷他定相當，說明麻黃堿在治療變應性鼻炎方面具有較好的療效。

Th2炎癥反應是變態反應性炎癥疾病的主要誘因。在變應性鼻炎的致敏階段，鼻黏膜的過敏原接觸T淋巴細胞，導致Th2淋巴細胞的出現。隨著Th2淋巴細胞的激活，產生導致IgE合成和肥大細胞增殖的細胞因子，如IL-3、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13［15］。當肥大細胞表面的過敏原遇到自身的特異性IgE時，早期的炎癥反應會導致肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放介質。這些物質包括IL-4、IL-6和COX2等介質，會引起鼻腔內的炎癥過程。高IgE水平是變態反應性疾病存在的重要標志。WINTHER等［16］研究表明，季節性變應性鼻炎患者的IgE水平升高，這與鼻炎的嚴重程度有關。一項OVA誘導的變應性鼻炎模型的研究表明，大鼠血清IgE水平升高［11］。此外，與血清IgE水平一樣，變應性鼻炎患者鼻黏膜局部IgE水平也升高［17］。IL-4和IL-13在變應性鼻炎中占有重要地位。這些Th2型細胞因子是淋巴細胞抗原呈遞功能所必需的，還通過產生IgE而導致過敏性炎癥［18］。IL-13在氣道高反應性、嗜酸性粒細胞浸潤和黏液纖毛分化中起重要作用。它還被證明能刺激鼻腔上皮細胞合成NO，從而加重血管擴張和呼吸道炎癥［19］。其他文獻報道，變應性鼻炎大鼠血清IgE、IL-4和IL-13水平明顯高于對照組［11，20］。在花粉誘導的變應性鼻炎模型中，IgE、IL-4和IL-13的水平也同樣升高［21］。本研究中，與對照組相比，變應性鼻炎大鼠血清IgE、IL-13和IL-4水平顯著升高，然而麻黃堿治療的大鼠血清IgE、IL-4和IL-13水平顯著降低。

致敏細胞因子胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP），是在上皮細胞和樹突狀細胞之間啟動變態反應性炎癥的主開關之一［22］。OX40與其配體OX40L是TSLP信號通路的下游分子，OX40L調控Th1和Th2細胞的分化過程。TSLP/OX40L是啟動和維持變應性鼻炎中Th2型免疫應答的重要信號通路［10］。在過敏性炎癥中TSLP能激活髓樣樹突狀細胞（DC）產生OX40L，從而觸發Th2炎癥反應［23］。本研究結果顯示，麻黃堿治療后，變應性鼻炎大鼠鼻黏膜組織中TSLP和OX40L的mRNA和蛋白表達均被抑制。結果提示，麻黃堿可能通過TSLP/OX40L通路調節變應性鼻炎大鼠Th2型免疫應答，從而發揮治療作用。

綜上所述，本研究表明麻黃堿對OVA誘導的變應性鼻炎大鼠具有良好的治療作用，麻黃堿可能通過TSLP/OX40L通路調節變應性鼻炎大鼠Th2型免疫應答，從而發揮治療作用。