牡荊素調控miR-219a-5p表達對LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥反應的影響

王偉平 王君 鄧飛 趙彩杰 韓景新

（唐山職業技術學院護理系，唐山 063300）

慢性氣道炎癥性疾病是多種細胞因子引起的慢性呼吸系統疾病，支氣管上皮細胞在維持氣道微環境穩態中起重要作用，支氣管上皮細胞損傷與感染性疾病的發生密切相關［1-2］。牡荊素是一種天然黃酮類化合物，可通過抗神經凋亡、調節炎癥因子對神經系統起保護作用［3］。牡荊素還可通過減少心肌細胞凋亡，降低炎癥因子水平保護心肌炎癥細胞免受CVB3病毒誘導的損傷［4］。但牡荊素對支氣管上皮細胞凋亡和炎癥反應的影響及機制尚不清楚。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可誘導機體炎癥反應，因此，本研究采用LPS刺激支氣管上皮細胞，觀察牡荊素對LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥反應的影響及機制，為慢性氣道炎癥性疾病治療提供新思路和新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料人支氣管上皮細胞系16HBE購自上海酶研生物科技有限公司；RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；LPS、牡荊素（純度≥95%）購自美國Sigma公司；TUNEL檢測試劑盒購自北京中山生物技術有限公司；凋亡檢測試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；IL-6、IL-13、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 肺損傷小鼠模型構建15只C57BL/6健康雄性小鼠隨機分為對照組、模型組、牡荊素低、中、高劑量組，每組3只。所有小鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，仰臥位固定于滴注板，吸除小鼠口咽部分泌物后將帶針芯的靜脈留置針插入氣管內，立即拔出針芯，模型組小鼠向氣管內快速滴注LPS（1 000 μg/ml，4 mg/kg），對照組注入等量生理鹽水，并立即注入空氣0.5 ml，牡荊素低、中、高劑量組先用LPS滴注，損傷模型成功建立后分別滴注1.5、3、6 mg/kg牡荊素。給藥結束后正常飼養小鼠24 h，麻醉處死小鼠后取肺組織，石蠟切片。

1.2.2 原位缺口末端標記法檢測小鼠肺組織細胞凋亡情況取各組小鼠石蠟切片，按試劑盒說明書操作，細胞核中有棕褐色顆粒者為陽性細胞，記錄3個高倍鏡視野下的凋亡細胞數，凋亡指數（%）=凋亡細胞數/3個高倍鏡視野下細胞總數×100%。

1.2.3 免疫組化法檢測小鼠肺組織IL-6、IL-13、TNF-α表達取各組小鼠肺組織石蠟切片（5 μm），脫蠟水化，抗原修復，3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，避光20 min，PPS洗2次，5 min/次；5%胎牛血清封閉，分別加入兔抗人IL-6、IL-13、TNF-α一抗，37℃孵育2 h，PPS洗2次，5 min/次；加入山羊抗兔二抗，PPS洗2次，5 min/次，DAB染色，蘇木素復染2 min，脫水，透明，封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.4 細胞培養與分組人支氣管上皮細胞系16HBE復蘇后接種于RPMI1640培養基（含10%胎牛血清），37℃、5%CO2培養，2~3 d傳代1次，取對數生長期細胞用于后續實驗。50 μg/ml LPS處理細胞16HBE，記為LPS組，正常培養的細胞作為對照組（Con），分別用25、50、100 mg/L牡荊素處理后再用50 μg/ml LPS處理，記為牡荊素低、中、高劑量組（LPS+VT-L、LPS+VT-M、LPS+VT-H）。將miR-NC、miR-219a-5p轉染至16HBE細胞后采用50 μg/ml LPS處理，記為LPS+miR-NC組、LPS+miR-219a-5p組；將anti-miR-NC、anti-miR-219a-5p轉染至16HBE細胞后采用100 mg/L牡荊素和50 μg/ml LPS處理，記為LPS+VT+anti-miR-NC組、LPS+VT+anti-miR-219a-5p組。

1.2.5 流式細胞術檢測16HBE細胞凋亡收集各組細胞，胰蛋白酶消化，調整細胞密度為6×104個/ml，將細胞接種于6孔板，繼續培養14 d，棄培養基，500 μl/孔加入胰蛋白酶消化細胞，細胞從培養板上脫落時加入血清終止消化，1 500 r/min離心5 min，棄培養基，重懸細胞，將細胞懸液轉移至EP管，4℃、1 500 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，5 min/次，棄PBS，加入200 μl結合緩沖液，加入5 μl Annexin VFITC振蕩混勻，室溫避光孵育15 min，加入10 μl PI染色液振蕩混勻，室溫避光孵育10 min，加入400 μl結合緩沖液振蕩混勻，過濾，FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Cellauest軟件計算。

1.2.6 Western blot檢測16HBE細胞Bcl-2、Bax蛋白表達提取各組細胞總蛋白，定量，進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉，分別加入相應的一抗（1∶800）4℃孵育過夜，加入二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，曝光顯影，定影，分析蛋白條帶灰度值，計算蛋白表達。

1.2.7 ELISA檢測IL-6、IL-13、TNF-α水平各組細胞培養48 h后取上清，稀釋標準品：酶標板內設標準孔，微量加樣器在酶標板第1、2孔內分別加入標準品（100 μl）與標準品稀釋液（50 μl），充分混勻，第3（100 μl）、4孔（100 μl）內分別加入混勻后的第1、2孔內液體、標準品稀釋液50 μl，按照上述方法稀釋標準品，待稀釋至第9、10孔時充分混勻，每孔加樣量均為50 μl，設置不加樣品孔與酶標試劑的空白對照孔，待測樣品孔內加入樣品稀釋液40 μl、上清10 μl，37℃水浴孵育30 min，按試劑盒說明書進行檢測。

1.2.8 RT-qPCR檢 測16HBE細 胞miR-219a-5p表達各組細胞培養48 h后提取細胞總RNA，將RNA反轉錄為cDNA，miR-219a-5p以U6為內參進行PCR擴增，2-ΔΔCt法計算相對表達。

1.3 統計學分析采用SPSS20.0軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 牡荊素對LPS誘導肺損傷小鼠模型肺部上皮細胞凋亡的影響與對照組相比，模型組小鼠肺部上皮細胞凋亡指數升高［（37.55±3.14）%vs（7.26±0.71）%］（P<0.05）；與模型組相比，牡荊素低、中、高劑量組小鼠肺部上皮細胞凋亡指數降低［（29.22±2.98）%、（22.13±2.06）%、（22.13±2.06）%vs（37.55±3.14）%］（P<0.05）。

2.2 牡荊素對LPS誘導肺損傷小鼠模型肺組織炎癥因子表達的影響與對照組相比，模型組小鼠肺組織中IL-6、IL-13、TNF-α陽性表達水平升高（P<0.05）；與模型組相比，牡荊素低、中、高劑量組小鼠肺組織中IL-6、IL-13、TNF-α陽性表達水平降低（P<0.05，圖1）。

圖1 牡荊素對LPS誘導肺損傷模型小鼠肺組織炎癥因子表達的影響（×100）Fig.1 Effect of vitexin on inflammatory factors expres?sions in lung tissue of LPS-induced lung injury model mice（×100）

2.3 牡荊素對LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥反應的影響與對照組相比，LPS組細胞凋亡率和Bax表達升高，Bcl-2表達降低，IL-6、IL-13、TNF-α含量增加（P<0.05）；與LPS組相比，牡荊素低、中、高劑量組細胞凋亡率和Bax表達降低，Bcl-2表達升高，IL-6、IL-13、TNF-α含量減少，且呈濃度依賴性（P<0.05，圖2）。

圖2 牡荊素對LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of vitexin on apoptosis of LPS-induced bron?chial epithelial cells

2.4 牡荊素對LPS誘導的支氣管上皮細胞中miR-219a-5p表達的影響與對照組相比，LPS組miR-219a-5p表 達 降 低（0.46±0.04 vs 1.00±0.07）（P<0.05）；與LPS組相比，牡荊素低、中、高劑量組miR-219a-5p表 達 升 高（0.59±0.05、0.71±0.06、0.86±0.06 vs 0.46±0.04），且呈濃度依賴性（P<0.05）。

2.5 miR-219a-5p過表達對LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥反應的影響與LPS+miR-NC組相比，LPS+miR-219a-5p組miR-219a-5p表達升高，細胞凋亡率和Bax表達降低，Bcl-2表達升高，IL-6、IL-13、TNF-α含量減少（P<0.05，圖3）。

圖3 miR-219a-5p過表達對LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of miR-219a-5p overexpression on apoptosis of LPS-induced bronchial epithelial cells

2.6 抑制miR-219a-5p表達逆轉牡荊素（100 mg/L）對LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥反應的作用與LPS+VT+anti-miR-NC組相比，LPS+VT+antimiR-219a-5p組miR-219a-5p表達降低，細胞凋亡率和Bax表達升高，Bcl-2表達降低，IL-6、IL-13、TNF-α含量增加（P<0.05，圖4）。

圖4 抑制miR-219a-5p表達逆轉了牡荊素對LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡的作用Fig.4 Inhibition of miR-219a-5p expression reversed effect of vitexin on LPS-induced apoptosis of bron?chial epithelial cells

3 討論

支氣管上皮細胞損傷在氣道炎癥性疾病發生發展中發揮重要作用，抑制支氣管上皮細胞分泌炎癥細胞因子，減少細胞凋亡可能是治療氣道炎癥性疾病的有效方法［5-6］。研究報道，牡荊素可抑制小鼠卵清蛋白誘導的過敏性哮喘中的炎癥反應［7］。牡荊素可通過抑制海馬神經細胞凋亡，降低TNF-α及干擾素-γ（interferon γ，IFN-γ）含量對大鼠神經細胞損傷起保護作用［8］。牡荊素可減輕LPS誘導的中性粒細胞募集和促炎細胞因子水平升高，從而減輕LPS誘導的急性肺損傷［9］。表明牡荊素具有抗炎作用。IL-13是Th2細胞分泌的細胞因子，是哮喘和慢性阻塞性肺疾病發病的重要細胞因子［10］。IL-6、TNF-α是促炎因子，在慢性阻塞性肺疾病中高表達［11］。本研究構建小鼠肺損傷模型后檢測肺部細胞凋亡情況，結果顯示，小鼠肺部上皮細胞凋亡指數降低。采用不同劑量牡荊素處理LPS誘導的支氣管上皮細胞，結果顯示，細胞凋亡率降低，IL-6、IL-13、TNF-α含量減少，且呈濃度依賴性，說明牡荊素可劑量依賴性地抑制LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥因子釋放。

研究報道，上調miR-219a-5p表達可提高細胞活性，抑制乳酸脫氫酶釋放和細胞凋亡，對腦缺血再灌注損傷起保護作用［12］。miR-219a-5p可通過抑制Th1/Th17介導的免疫應答抑制腸道炎癥［13］。原兒茶酸可激活miR-219a-5p表達緩解慢性酒精性肝病［14］。表明miR-219a-5p具有抗炎及抗氧化作用。本研究顯示，miR-219a-5p過表達后支氣管上皮細胞凋亡率降低，IL-6、IL-13、TNF-α含量減少，且肺損傷模型小鼠肺組織中IL-6、IL-13、TNF-α陽性表達水平降低，說明過表達miR-219a-5p可抑制LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥因子釋放。此外，本研究還發現牡荊素可提高miR-219a-5p表達，而抑制miR-219a-5p表達逆轉了牡荊素對LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥反應的作用。

綜上所述，牡荊素可能通過上調miR-219a-5p表達抑制LPS誘導的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥因子釋放。