木蘭花堿通過ROS/KRAS/AMPK抑制結直腸癌sw480細胞干性特征和糖酵解①

劉璨 劉艾鑫 姜昌鎬

（延邊大學附屬醫院，延吉 133000）

結直腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一，在我國其發病率和病死率分別排第3位和第5位，且呈逐年上升趨勢［1］。盡管目前針對結直腸癌臨床已有較為系統的治療方案，如放療、化療等，但耐藥性及較強的副作用嚴重降低患者的生存率和生存質量。木蘭花堿（magnoflorine，Mag）屬于阿樸啡類生物堿，廣泛存在于防己科等藥用植物中，具有抗氧化、降血糖等藥理作用［2］。此外，研究表明Mag能夠抑制胃癌進展并通過AKT/mTOR和p38信號通路提高乳腺癌細胞對阿霉素的藥物敏感性［3-4］。然而Mag對結直腸癌細胞的影響尚未見報道。本研究以不同濃度Mag處理人結直腸癌sw480細胞，觀察Mag對結直腸細胞干性及糖酵解的影響并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料人結直腸癌細胞株sw480購自中國科學院細胞庫；Mag購自上海源葉生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）、活性氧檢測試劑盒購自索萊寶；活性氧誘導劑購自貝博生物有限公司；葡萄糖和乳酸試劑盒購自Sigma；CD133（64326）、p-AMPK（2537）、AMPK（5831）、KRAS（53270）和GAPDH（5174）抗體購自Cell Signaling Technology。電泳儀及電泳槽（E-C Apparatus Corporation，美國）；全波長酶標儀、Western blot轉膜儀、Cytation5熒光成像系統和Gel Doc凝膠成像儀（Bio-Rad，美國）；流式細胞儀（Beckman Coulter，美國）。

1.2 方法

1.2.1 CCK8增殖實驗取對數生長期的sw480細胞以2×104個/孔接種于96孔板，待細胞生長至70%左右后，按照實驗分組加入不同濃度的Mag（0、10、20、40 μmol/L），分別于24 h、48 h和72 h加入CCK-8試劑（10 μl/孔），2 h后測定450 nm處的吸光度（OD）值。以時間點為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制各組細胞OD值變化，并進行統計學分析。

1.2.2 球體形成實驗sw480細胞經不同濃度Mag處理48 h后，以3 000個/孔接種于低黏附6孔板中。DMEM/F12培養液（含20 ng/ml EGF、10 ng/ml bFGF和10 μl/ml B27）培養2周，分別于第1、7、14天拍照，并計數克隆形成數量。

1.2.3 球體免疫熒光實驗收集成球細胞，經4%多聚甲醛固定、0.2% Triton X-100通透以及3%BSA封閉后，加入CD133抗體（1∶200）孵育2 h，PBS清洗后，加入FITC標記的熒光二抗。含DAPI抗熒光淬滅封片劑封片后，Cytation5熒光成像系統進行拍照。

1.2.4 糖酵解檢測實驗sw480細胞經不同濃度Mag處理24 h后，分別提取蛋白，根據試劑盒說明書分別檢測細胞葡萄糖消耗和乳酸生成。

1.2.5 流式細胞術sw480細胞接種于6孔板，經不同濃度Mag處理后，每孔加入10 μmol/L DCFH-DA 1 ml，37℃孵育30 min后，PBS清洗3次，流式細胞儀檢測細胞內ROS水平。

1.2.6 Western blot實驗收集細胞碎片進行裂解，每孔30 μg蛋白經10%SDS-PAGE電泳（120 V、90 min）根據分子量分離蛋白樣品，然后在300 mA、60 min條件下，將蛋白從凝膠轉移至PVDF膜。經5%脫脂奶粉TBST緩沖液室溫封閉2 h后，分別加入抗體p-AMPK（1∶1 000）、AMPK（1∶1 000）、KRAS（1∶2 000）和GAPDH（1∶3 000）室溫孵育2 h，TBST清洗3次后，加入HRP標記的羊抗兔和羊抗鼠二抗（1∶8 000）室溫孵育2 h，凝膠成像系統進行拍照。

1.3 統計學分析計量數據以±s表示，用Graphpad Prism 8.0統計軟件進行分析，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Mag對sw480細胞活性的影響以不同濃度梯度的Mag處理sw480細胞，并通過CCK-8檢測不同時間點細胞活性變化結果如表1所示，與對照組（Mag 0 μmol/L）相比，Mag給藥組（10、20、40 μmol/L）細胞活性在24 h、48 h和72 h均明顯降低。

表1 各組細胞OD480 nm值比較（±s，n=3）Tab.1 Comparison of cell OD480 nm in each group（±s，n=3）

表1 各組細胞OD480 nm值比較（±s，n=3）Tab.1 Comparison of cell OD480 nm in each group（±s，n=3）

Note：Compared with Mag control（0 μmol/L）group，1）P<0.01，2）P<0.001.

Groups Mag 0 μmol/L Mag 10 μmol/L Mag 20 μmol/L Mag 40 μmol/L 24 h 0.93±0.049 0.69±0.0501）0.61±0.0302）0.52±0.0302）48 h 1.33±0.08 0.85±0.041）0.75±0.031）0.63±0.022）72 h 1.95±0.05 1.13±0.052）0.89±0.042）0.77±0.052）

2.2 Mag對sw480細胞球體形成大小和數量的影響Mag處理后，球體形成實驗結果顯示，第7天各組細胞球體形成數量分別為193.67±8.74、129.67±12.22、95.67±13.32、54.67±7.37。第14天球體形成 數 量 分 別 為406.67±20.40、226.33±25.15、14.33±17.62、83.00±10.15。與對照組相比，Mag給藥組球體形成大小和數量均降低，表明Mag能夠抑制sw480細胞球體形成能力。見圖1。

圖1 Mag對sw480細胞球體形成大小和數量的影響Fig.1 Effect of Mag on size and number of sw480 spheroids

2.3 Mag對sw480球體細胞CD133蛋白表達的影響收集各組球體細胞，球體免疫熒光檢測細胞內CD133蛋白表達。結果表明，與對照組相比，Mag給藥組球體細胞減小、熒光強度減弱，提示Mag抑制sw480球體細胞CD133蛋白表達（圖2）。

圖2 Mag對sw480球體細胞CD133蛋白表達的影響Fig.2 Effect of Mag on CD133 protein expression in sw480 spheroid cells

Note：Compared with Control group，**.P<0.01；***.P<0.001；****.P<0.000 1.

2.4 Mag對sw480細胞糖酵解的影響不同濃度Mag處理24 h后收集細胞，比色法分別檢測細胞葡萄糖攝取及乳酸生成。結果表明，各組細胞葡萄糖攝取量分別為（10.32±1.12、7.11±0.86、4.60±0.75、2.93±0.31）nmol/μg。各組乳酸生成量分別為（7.62±0.69、5.57±0.59、3.95±0.47、2.25±0.28）nmol/μg。與對照組相比，Mag處理后，細胞葡萄糖攝取及乳酸生成均降低（P<0.01，P<0.001或P<0.000 1），提示Mag抑制sw480細胞糖酵解（圖3）。

2.5 Mag對sw480細胞ROS水平的影響Mag處理后，流式細胞術結果顯示，各組細胞內ROS平均熒光強度（×103）分別為53.44±3.76、38.20±3.17、21.94±3.10、13.00±5.66。與對照組相比，Mag給藥組細胞內ROS水平降低（F=58.32，P<0.000 1），提示Mag抑制sw480細胞內ROS水平（圖4）。

圖4 Mag對sw480細胞ROS的影響Fig.4 Effect of Mag on ROS in sw480 cells

2.6 Mag對sw480細胞KRAS/AMPK信號通路的影響Mag及活性氧誘導劑（RA）處理后，收集細胞提取蛋白，Western blot檢測細胞內KRAS/AMPK信號通路相關蛋白表達。結果顯示，與對照組相比，Mag處理后細胞內KRAS和p-AMPK表達水平均降低（P<0.01）。與Mag組相比，Mag和RA聯合處理組KRAS和p-AMPK表達水平升高（P<0.05）。提示Mag通過降低ROS水平抑制KRAS/AMPK信號通路（圖5）。

圖5 Mag對sw480細胞KRAS/AMPK信號通路的影響Fig.5 Effect of Mag on KRAS/AMPK signaling pathway in sw480 cells

3 討論

盡管癌癥治療取得了重大進展，但患者的存活率仍然很低。標準抗癌療法不充分的療效和嚴重的副作用引起了研究者對天然藥物的興趣，以確定具有良好化療性能的植物來源的生物活性化合物。Mag是一種廣泛存在于多種植物中的四元阿樸啡生物堿，OKON等［5］發現Mag對肺癌、乳腺癌、膠質瘤和橫紋肌肉瘤細胞均具有抑制作用。腫瘤干細胞是腫瘤中具有自我更新、自我修復能力的永生化增殖性細胞亞群，與結直腸癌的轉移、化療耐藥及復發密切相關［6-7］。WANG等［8］研究表明蒼術內酯Ⅰ通過抑制腫瘤細胞干性發揮對結直腸癌的抗癌作用。本研究發現，Mag能夠抑制sw480細胞活性及成球能力并下調其球體細胞中CD133的表達，表明Mag可能通過調控結直腸癌細胞干性特征抑制其增殖。

最近，代謝重編程被認為是癌細胞的核心特征，其中最受關注的有氧糖酵解也被稱為Warburg效應。在糖酵解過程中，癌細胞增加葡萄糖消耗以滿足快速生長所需的高能量和大分子需求，驅動癌細胞的惡性進展［9-10］。本研究發現Mag處理后，sw480細胞葡萄糖攝取及乳酸生成水平明顯下降，表明Mag能夠抑制結直腸癌細胞糖酵解。

與正常細胞相比，腫瘤細胞內存在更高水平的ROS，從而維持生物學活動。腫瘤細胞的過度增殖伴隨高ROS的產生，盡管ROS具有一定的細胞毒性，但腫瘤細胞能夠適應這種氧化負荷并茁壯成長。此外，腫瘤細胞通過增加其抗氧化狀態以優化細胞內ROS水平，從而實現對增殖的促進，同時避免觸發衰老、細胞凋亡或鐵死亡［11］。MOLONEY等［12］研究表明癌細胞中高水平的ROS可通過減弱PTEN和MAPK磷酸酶活性來刺激增殖和細胞存活。為了維持高ROS水平對增殖的促進作用，同時降低衰老或細胞死亡的風險，腫瘤細胞通過多種方式上調抗氧化轉錄因子和/或重新編程代謝［11-12］。研究表明，癌細胞內ROS水平與干性特征及細胞代謝均密切相關［13］。致癌基因KRAS可誘導多種癌癥的表型特征，包括干性特征增強及細胞代謝改變［14-15］。AMPK是一種保守的能量傳感器，是細胞代謝的主要調節劑。研究表明，ROS/KRAS/AMPK信號能夠促進吉西他濱誘導的胰腺癌干細胞特性中的作用［15］。本研究發現Mag能夠抑制sw480細胞中的ROS水平，并通過抑制ROS抑制KRAS/AMPK信號通路，表明Mag能夠抑制結直腸癌細胞中ROS/KRAS/AMPK信號通路。

綜上所述，Mag能夠抑制結直腸癌細胞sw480的干性特征及糖酵解水平，其機制可能與抑制細胞中ROS/KRAS/AMPK信號通路有關。