橙皮素通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控肝癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的機制研究

李曉媛 郭昊翊 郭敏娟 耿楠 黃真珍

（鄭州大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450000）

肝癌是一種始于肝臟的惡性腫瘤，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種類型，其中原發(fā)性肝癌是全球第六大最常見的癌癥類型［1］。原發(fā)性肝癌易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，惡性程度高，患者預(yù)后差、易復(fù)發(fā)、病死率較高。肝癌占癌癥總數(shù)的5.7%，目前僅中國肝癌發(fā)病人數(shù)就占全世界肝癌患者的55%［2］。盡管在肝癌的治療方面取得了巨大進展，包括手術(shù)、栓塞、化學(xué)療法和靶向治療，但患者的五年生存率仍然很低［3］。因此，有必要尋找低毒、高效的抗肝癌藥物以阻礙肝癌的進展。橙皮素（hesperetin）一種來源于蕓香科柑橘屬的類黃酮物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎等多種生物學(xué)功能［4］。以往研究顯示，橙皮素具有降血脂、保護心血管、降壓等作用，最近研究發(fā)現(xiàn)，其在抗腫瘤方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用［5-6］。研究表明，橙皮素能夠顯著抑制乳腺癌細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡［7］。COUTINHO等［8］研究顯示，橙皮素可誘導(dǎo)骨肉瘤細胞停滯于G2期，抑制細胞生長。但是，目前尚不完全了解橙皮素對肝癌細胞生物學(xué)行為的影響及作用機制。因此，本研究旨在探究橙皮素對肝癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響及其可能的作用機制，以期為臨床上開發(fā)高效、低毒的抗肝癌候選藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人肝癌細胞MHCC97H購自美國ATCC細胞庫；橙皮素（質(zhì)量分數(shù)99%）購自上海源葉生物有限公司；DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司；胎牛血清、胰蛋白酶購自美國HyClone公司；CCK-8細胞活性檢測試劑購自日本同仁化學(xué)研究所；AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl購自美國Sigma公 司；Cleaved Caspase-3（1∶800稀 釋）和Cleaved Caspase-9（1∶800稀釋）抗體購自美國SAB公司；MMP-2（1∶500稀釋）、MMP-9（1∶500稀釋）、β-catenin（1∶500稀釋）、c-myc（1∶500稀釋）和Cyclin D1（1∶500稀釋）抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP標記的IgG二抗購自美國CST公司；DMSO購自上海索萊寶生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)肝癌MHCC97H細胞用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置在37℃、含5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行孵育，每隔1 d更換1次新的培養(yǎng)液，待細胞貼壁匯合至90%左右時，用胰蛋白酶消化細胞，以1∶3或1∶4的 比 例 進 行傳 代，取 對 數(shù) 生 長 期 的MHCC97H細胞用于后續(xù)實驗研究。

1.2.2 CCK-8檢測對數(shù)期的MHCC97H細胞以2×104個/孔接種到96孔板中，放置在37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，待細胞生長到50%融合時，用不同濃度的橙皮素（0、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L）干預(yù)MHCC97H細胞24 h，同時設(shè)置空白調(diào)零孔，干預(yù)結(jié)束后棄去原培養(yǎng)液，向每孔細胞中加入含10 μl CCK-8試劑不含血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，使用酶標儀測定每孔細胞的光密度值（OD值），設(shè)置波長為450 nm，計算不同濃度的橙皮素對細胞存活率的影響，細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白調(diào)零孔OD值）/（對照組OD值-空白調(diào)零孔OD值）×100%。并使用GraphPad Prism軟件算出橙皮素處理MHCC97H細胞24 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.3 實驗分組和處理對數(shù)期的MHCC97H細胞接種到6孔板中，實驗分為Con組、HPT組和HPT+LiCl組。Con組的MHCC97H細 胞 未 行處 理，HPT組 的MHCC97H細 胞 以2.5 μmol/L HPT干 預(yù)24 h，HPT+LiCl組的MHCC97H細胞以2.5 μmol/L HPT和10 mmol/L Wnt/β-catenin信號通路 激 活 劑LiCl干預(yù)24 h。

1.2.4 集落形成實驗MHCC97H細胞分組和處理后以5×102個/孔接種到6孔板中，每隔2 d更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 d后，肉眼觀察到集落時終止培養(yǎng)，以4%多聚甲醛固定30 min，以1%結(jié)晶紫染色15 min，用蒸餾水洗去染液，晾干后統(tǒng)計每孔集落形成數(shù)，分別計算各組細胞集落形成率，集落形成率（%）=集落形成數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測對數(shù)期的MHCC97H細胞以2×105個/孔種植到96孔板中，按1.2.3分組處理24 h后，離心收集各組MHCC97H細胞，PBS洗滌細胞2次，加入500 μl Binding buffer重懸細胞制成單細胞懸液，隨后加入AnnexinⅤ-FITC和PI各5 μl，避光染色15 min，隨即通過流式細胞儀測定并分析細胞凋亡率。

1.2.6 Transwell實驗對數(shù)期的MHCC97H細胞以1.2.3分組處理24 h后，收集細胞，用不含血清的培養(yǎng)液懸浮細胞制成細胞懸液，分別取200 μl細胞懸液添加到Transwell小室的上室（侵襲實驗中Tran?swell小室的上室覆蓋有Matrigel基質(zhì)膠，遷移實驗中Transwell小室的上室無Matrigel基質(zhì)膠覆蓋），在下室添加500 μl含胎牛血清的培養(yǎng)液，將小室放置在常規(guī)培養(yǎng)箱孵育24 h，除去小室內(nèi)的培養(yǎng)液，以PBS洗滌細胞，再以4%多聚甲醛固定細胞20 min，PBS洗滌后以結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗滌后晾干，使用倒置顯微鏡觀察穿膜細胞數(shù)，隨機選取5個視野計侵襲或遷移細胞數(shù)。

1.2.7 Western blot實驗MHCC97H細胞按照上述1.2.3方法分組處理24 h后，收集各組細胞，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，放置在冰上30 min，離心收集上清液即蛋白樣品，采用BCA法測定蛋白濃度，制備10%的SDS-PAGE凝膠，取等量蛋白樣品上樣，行凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，將膜置于含5%脫脂奶粉的封閉液中孵育2 h，洗膜后加入相應(yīng)稀釋的一抗，4℃過夜孵育，洗膜后加入HRP標記的IgG二抗，室溫孵育2 h，洗膜后以ECL化學(xué)發(fā)光試劑進行顯色，以GAPDH進行標定，采用Image J軟件分析各組細胞中目的蛋白相對表達情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析以上實驗均重復(fù)3次，取均值，實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，多組間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩差異比較采用SNK-q檢驗分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 橙皮素干預(yù)MHCC97H細胞作用濃度篩選

CCK-8檢測結(jié)果顯示（圖1），在一定濃度范圍內(nèi)橙皮素能夠抑制MHCC97H細胞存活率并呈濃度依賴性，隨著橙皮素濃度的增加，MHCC97H細胞存活率隨之降低，橙皮素干預(yù)MHCC97H細胞24 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）為4.77 μmol/L。根據(jù)CCK-8檢測結(jié)果，將接近1/2 IC50濃度為2.50 μmol/L作為后續(xù)實驗劑量。

圖1 不同濃度的橙皮素對MHCC97H細胞存活率的影響Fig.1 Effect of hesperidin with different concentrations on survival rate of MHCC97H cells

2.2 各組MHCC97H細胞增殖能力比較CCK-8和集落形成實驗結(jié)果顯示（圖2），與Con組相比，HPT組MHCC97H細胞OD值和集落形成率均明顯降低（P<0.05）。與HPT組相比，HPT+LiCl組細胞OD值和集落形成率均明顯升高（P<0.05）。

圖2 各組MHCC97H細胞OD值和集落形成率比較Fig.2 Comparison of OD value and colony forming rate of MHCC97H cells in each group

2.3 各組MHCC97H細胞凋亡情況比較流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示（圖3），與Con組相比，HPT組MHCC97H細胞凋亡率明顯升高（P<0.05），與HPT組相比，HPT+LiCl組細胞凋亡率明顯降低（P<0.05）。

圖3 橙皮素對肝癌MHCC97H細胞凋亡率的影響Fig.3 Effect of hesperidin on apoptosis rate of MHCC97H cells in hepatoma

2.4 各組MHCC97H細胞侵襲和遷移能力比較Transwell實驗檢測結(jié)果顯示（圖4），與Con組相比，HPT組MHCC97H細胞侵襲和遷移數(shù)均明顯減少（P<0.05），與HPT組相比，HPT+LiCl組侵襲和遷移細胞數(shù)均明顯增多（P<0.05）。

圖4 各組MHCC97H細胞侵襲和遷移細胞數(shù)比較Fig.4 Comparison of invasion and migration of MHCC97H cells in each group

2.5 各組MHCC97H細胞中蛋白表達水平比較Western blot檢測結(jié)果顯示（圖5），與Con組相比，HPT組MHCC97H細 胞 中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達明顯上調(diào)（P<0.05），MMP-2和MMP-9的表達明顯下調(diào)（P<0.05），與HPT組相比，HPT+LiCl組細胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達明顯下調(diào)（P<0.05），MMP-2和MMP-9的表達明顯上調(diào)（P<0.05）。

圖5 橙 皮 素 對Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、MMP-2和MMP-9表達的影響Fig.5 Effect of hesperidin on expressions of Cleaved Caspase-3，Cleaved Caspase-9，MMP-2 and MMP-9

2.6 各組MHCC97H細胞中Wnt/β-catenin信號通路激活水平比較Western blot檢測結(jié)果顯示（圖6），與Con組相比，HPT組MHCC97H細胞中β-catenin、c-myc和Cyclin D1表達水平均明顯降低（P<0.05），與HPT組相比，HPT+LiCl組細胞中β-catenin、c-myc和Cyclin D1表達水平均明顯升高（P<0.05）。

圖6 橙皮素對Wnt/β-catenin信號通路激活的影響Fig.6 Effect of hesperidin on Wnt/β-catenin signaling pathway activation

3 討論

橙皮素是一種黃酮類化合物，普遍存在于蕓香科柑橘屬的幼果中。在臨床中，橙皮素長期以來一直用于治療心血管疾病、炎癥以及搶救休克［9］。橙皮素能夠影響包括細胞氧化應(yīng)激、自噬、線粒體損傷、鈣平衡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等生物學(xué)過程［10］。最近，苦參堿的抗腫瘤特性引起了廣大學(xué)者的關(guān)注。有研究顯示橙皮素以Caspase-3依賴的方式促進人肺癌H522細胞的凋亡［11］。此外橙皮素可以通過線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑通過ROS的積累來誘導(dǎo)食管癌細胞的細胞凋亡［12］。在前列腺癌中，橙皮素處理可導(dǎo)致細胞增殖受到抑制，并誘導(dǎo)細胞周期停滯在G1期［13］。LEE等［14］研究發(fā)現(xiàn)，橙皮素和柚皮素可通過下調(diào)FAK和p38信號通路抑制人胰腺癌細胞的生長和遷移。這些證據(jù)表明橙皮素對不同類型癌癥的發(fā)展和進程產(chǎn)生影響。趙雨欣等［15］研究發(fā)現(xiàn)，橙皮素衍生物對肝癌細胞具有促凋亡作用。但是，尚不完全了解橙皮素調(diào)節(jié)肝癌細胞生物學(xué)行為的影響和分子機制。本實驗首先采用不同濃度的橙皮素干預(yù)肝癌MHCC97H細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)橙皮素能夠抑制MHCC97H細胞的存活率。后續(xù)實驗結(jié)果顯示，橙皮素不僅可誘導(dǎo)MHCC97H細胞凋亡，對細胞侵襲和遷移能力均有抑制作用。Caspase-3和Caspase-9均為Caspase家族成員，與真核細胞凋亡密切相關(guān)。Caspase-9是細胞凋亡的啟動者，受信號刺激引起Caspase級聯(lián)反應(yīng)，啟動死亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，Caspase-3是細胞凋亡的執(zhí)行者，可直接降解細胞內(nèi)功能蛋白引發(fā)凋亡［16］。MMP-2和MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，在腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［17］。本實驗Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，橙皮素干預(yù)的MHCC97H細胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表達明顯上調(diào)，MMP-2和MMP-9的表達明顯下調(diào)。提示橙皮素可能通過Caspase-3方式誘導(dǎo)MHCC97H細胞凋亡，通過調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達阻礙細胞侵襲和遷移。這些實驗結(jié)果提示橙皮素對肝癌的發(fā)展和進程具有一定的抑制作用。

Wnt/β-catenin信號通路參與胚胎發(fā)育和致癌過程中的生理病理過程。目前已經(jīng)在不同類型的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑的異常激活［18-20］。在10%~50%的肝癌腫瘤中觀察到β-catenin異常表達，并且β-catenin的高表達與腫瘤的進展和不良的預(yù)后相關(guān)［21］。因此可通過阻斷Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以達到治療肝癌的目的。為探究橙皮素對肝癌細胞生物學(xué)行為影響的機制，本實驗檢測了Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)橙皮素干預(yù)的MHCC97H細胞中β-catenin、c-myc和Cyclin D1的表達均明顯下調(diào)，提示橙皮素可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活抑制MHCC97H細胞增殖、侵襲和遷移，并促進細胞凋亡。為驗證該推測，本實驗在橙皮素干預(yù)的MHCC97H細胞中添加Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl，結(jié)果顯示LiCl能夠部分逆轉(zhuǎn)橙皮素對MHCC97H細胞增殖、侵襲和遷移能力的抑制作用，阻礙橙皮素誘導(dǎo)的MHCC97H細胞凋亡。這些實驗結(jié)果證實了橙皮素對肝癌MHCC97H細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的調(diào)節(jié)作用是通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路來實現(xiàn)的。

綜上所述，橙皮素可有效抑制人肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡，下調(diào)Cleaved Caspase-3/9的表達，上調(diào)MMP-2/9的表達。此外，橙皮素能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)蛋白β-catenin、c-myc和Cyclin D1的表達。因此，橙皮素可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制肝癌的進程。本實驗為解析橙皮素的藥理機制提供一些理論依據(jù)，為橙皮素用于肝癌的臨床治療提供一定的實驗依據(jù)。