·基礎免疫學·LncRNA CASC7/miR-98-5p/SIRT3軸調控慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥反應和平滑肌細胞變化①

梁海梅 歐宗興 王蕾 陳忠仁

（中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院呼吸與危重癥醫學科，海口 570208）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmo?nary disease，COPD）是一種氣流受限的阻塞性肺部疾病，病死率逐年增高［1］。目前對COPD的治療方案多采取藥物+戒煙+心理治療，嚴重時需要吸氧并使用激素治療，影響患者的生活質量［2-4］。

長 鏈 非 編 碼RNA（long non-coding RNAs，LncRNAs）的異常表達被證實在包括COPD在內的多種疾病的發生發展中扮演重要角色［5］。隨著分子生物學的發展，發現了很多在COPD中起作用的LncRNAs，如LncRNA MCM3AP-AS1在COPD中 表達下調，過表達MCM3AP-AS1能夠抑制支氣管平滑肌細胞（bronchial smooth muscle cells，BSMCs）增殖［6］；敲除LncRNA TUG1可減輕COPD的肺部炎癥損傷［7］。但仍然有很多LncRNAs在COPD中的作用不明確，LncRNA CASC7位于NC_000008.11染色體8，曾被證實可抑制非小細胞肺癌的生長和侵襲，同時也可增強重癥哮喘患者對激素治療的敏感性［8-9］。miRNA也屬于非編碼RNA的一個亞類，目前對于miRNA的研究熱點在于被上游LncRNAs海綿化吸附，導致生物學功能被抑制。本研發現了CASC7與miR-98-5p堿基互補配對序列，而miR-98已經被MUSRI等［10］證實在COPD患者中過表達。本研究還發現了miR-98-5p的下游靶基因沉默信息調節因子3（Sirtuin3，SIRT3），既往研究報道SIRT3在COPD中可改善氧化應激導致的細胞損傷［11］。

本研究旨在對CASC3在COPD中的作用進行探討，并希望明確其具體調控機制，為COPD的診斷和治療提供新的作用靶點。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床樣本資料40例因肺癌切除術（不伴有COPD）切除的癌旁正常肺組織（距離原發灶邊緣至少2~5 cm，且肉眼可見無肺癌浸潤），患者無吸煙史。其中男27例，女13例，年齡28~66歲。40例吸煙的非COPD健康志愿者，其中男30例，女10例，年齡31~72歲，煙齡7.3~18.1年，肺功能正常。2017年6月至2019年10月于中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院就診的60例患有COPD的吸煙患者，其中男45例，女15例，年齡35~68歲，煙齡7.6~17.9年。COPD患者均是首次診斷為COPD，同時不伴有其他嚴重性或慢性臨床疾病。每組志愿者均取肺組織和痰液標本，在樣本收集之前所有志愿者均簽署書面知情同意書，本研究經中南大學湘雅醫院附屬海口醫院倫理委員會批準。

1.1.2 實驗動物12只C57BL/6J雄性大鼠購自南京大學南京生物醫學研究所，7周齡，體質量（216±20）g。于20℃~25℃、濕度50%~65%下飼養。

1.1.3 實驗試劑與儀器脂多糖（LPS）由北京索萊寶科技有限公司提供；TRIzol試劑、胎牛血清、Lipofectamine3000試劑盒、miR-98-5p模擬物與抑制劑、酶標儀、BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜、化學發光劑均由美國賽默飛世爾科技有限公司提供；沉默SIRT3的siRNA質粒由圣克魯斯生物技術有限公司提供；過表達CASC7的pcDNA3.1質粒由湖南優寶生物科技有限公司提供；逆轉錄試劑盒、qRT-PCR SuperMix試劑盒由北京全式金生物技術有限公司提供；CFX96Touch系統由美國伯樂公司提供；FISH試劑盒由廣州伯信生物科技有限公司提供；平滑肌細胞培養基由寧波明舟生物科技有限公司提供；pGL3載體由淼靈質粒平臺提供；人IL-6、IL-8、TNF-α ELISA檢測試劑盒由上海將來實業股份有限公司提供；PI3K、p-PI3K、GAPDH一抗、HRP標記的IgG二抗均由英國Abcam提供；CCK-8試劑盒由上海漢恒生物科技有限公司提供；使用的紅玫瑰牌香煙由廣東卷煙廠提供，每支含焦油13 mg，尼古丁1.3 mg。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒由上海前塵生物科技有限公司提供；流式細胞儀由貝克曼庫爾特提供。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立與體內轉染取12只C57BL/6J大鼠，隨機分為對照組和COPD模型建立組。對照組置于無菌無煙環境下飼養。COPD組使用LPS灌胃，隨后在香煙煙霧（cigarette smoke，CS）室中暴露2個月（5 d/周，4次/d，2 h/次，8支/h）。每隔2周向大鼠鼻腔內注射過表達質粒pcDNA3.1-CASC7及陰性對照、miR-98-5p模擬物和miR-98-5p抑制劑以及相應陰性對照；沉默質粒si-SIRT3與陰性對照物。最后1次暴露結束24 h后，以100 mg/kg劑量給予戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，取出肺組織。本研究所有程序均按照相關指導原則和規定進行。

1.2.2 HE染色使用多聚甲醛固定左側肺葉組織，依次二甲苯脫水、梯度乙醇透明、浸蠟、包埋、切片，行HE染色，封片，顯微鏡下觀察。

1.2.3 大鼠BSMCs的分離與轉染急性酶分離法分離BSMCs，首先將生理緩沖液預冷，取出大鼠肺臟后置于其中，通入混合氣體（O2∶CO2=19∶1），將支氣管主干分離，在解剖顯微鏡下再將肺動、靜脈、間質組織、結締組織及神經纖維等剝離，最后去除上皮組織。將處理好的氣管平滑肌置于生理緩沖液并剪碎（1 mm×1 mm），加入膠原酶、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白、NaCl、KCl、MgCl2、葡萄糖配制成的消化液中，1 h后終止消化得到BSMCs，并重懸，接種于6孔板中，置于培養箱中培養。6 h左右細胞融合度變為70%~90%，進行細胞轉染。轉染步驟按照Lipofectamine3000試劑盒說明書進行。

1.2.4 qRT-PCR TRIzol試劑用于提取組織和血漿樣本中的總RNA，使用逆轉錄試劑盒將RNA合成第一鏈cDNA，最后再使用qRT-PCR SuperMix試劑盒在CFX96 C1000系統上完成定量逆轉錄酶聚合酶鏈反應，使用2-ΔΔCt方法計算相對表達量，使用U6和GAPDH將數據規范化。本實驗使用的引物由北京博爾邁生物技術有限公司提供，序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.2.5 亞細胞定位加入4%多聚甲醛將細胞固定于6孔板，使用1 ml DEPC水洗滌2次，5 min/次；向孔板中加入1 ml/孔的通透液，10 min后棄掉通透液并使用PBS洗滌3次，5 min/次；加入蛋白酶K工作液，使其與細胞均勻接觸，孵育10 min，PBS洗滌2次，5 min/次，經多聚甲醛再固定與梯度乙醇脫水，干燥后進行下一步實驗。在處理好的樣本上滴加20 μl的預雜交液，37℃下封閉孵育30 min，在冰上將探針與雜交液（1∶40）混合成雜交反應液，滴加30μl雜交反應液于樣本，73℃下反應5 min，最后在37℃過夜孵育。經2×SSC洗滌后加入DAPI進行染核，封片后使用共聚焦顯微鏡拍照觀察。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗在基礎報告載體pGL3上插入CASC7野生型、突變型序列（CASC7-WT、CASC7-MUT）和SIRT3野生型、突變型（SIRT3-WT、SIRT3-MUT）序列的3'UTR端，將293T細胞植入孔板，再使用Lipofectamine3000試劑將克隆好的報告載體與miR-98-5p NC、miR-98-5p mimic共轉染至細胞，靜置48 h后，應用雙熒光素酶基因報告系統評價各組細胞的螢火蟲熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作為標準化參考。

1.2.7 ELISA應用ELISA試劑盒檢測BSMCs上清液和大鼠血清中的IL-6、IL-8和TNF-α分泌水平，簡單步驟如下：孔板設置空白孔、標準孔、樣本孔，標準孔中加入50μl標準品，樣本孔中加入50μl樣本，再向標準孔和樣本孔中同時加入100μl HRP標記的待測抗體，封閉孔板，37℃下孵育60 min。洗滌干燥后向孔中加入底物，37℃暗室中孵育15 min，加入終止液，酶標儀檢測波長為450 nm處的OD值。

1.2.8 Western blot細胞經過RIPA裂解液完全裂解后，得到的產物為總蛋白樣本，蛋白經BCA試劑盒定量后，加熱變性，SDS-PAGE分離蛋白，再將其轉移至PVDF膜，并使用5%脫脂牛奶對其封閉1 h，加入PI3K（1∶1 000）、p-PI3K（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）一抗，膜上孵育，4℃過夜。TBST洗滌3次，膜上加入HRP標記的IgG（1∶5 000）二抗孵育，2 h后加入化學發光劑（ECL）將蛋白條帶信號放大，并分析條帶灰度值，以GAPDH進行標準歸一化。

1.2.9 CCK-8將待測細胞重懸，密度調整為2×104個/ml，植入96孔板，2×103個/孔，放入培養箱中，每隔24 h使用CCK-8溶液檢測1次細胞存活狀態，直至培養到96 h進行最后1次檢測。測量450 nm處吸光度值，繪制成曲線。

1.2.10 流式細胞術細胞凋亡程度使用Annexin VFITC/PI雙染色法檢測，孔板中以每孔2×106個細胞進行接種，加入培養基培養24 h。PBS洗滌細胞，細胞在緩沖液中重懸，加入Annexin V-FITC和PI染色液，孵育30 min，細胞凋亡率采用流式細胞儀檢測。

1.3 統計學分析本實驗采用±s的形式統計數據，并采用SPSS22.0和GraphPad Prism軟件進行分析。兩組間差異使用t檢驗，多組間差異使用單因素分析法，P<0.05表示差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 CASC7在COPD中表達降低，miR-98-5p表達升高qRT-PCR檢測收集的臨床樣本，結果顯示，與非吸煙者的肺組織相比，非COPD吸煙者和COPD患者肺組織中CASC7表達降低，miR-98-5p表達上升（均P<0.05），且CASC7與miR-98-5p的表達呈負相關（r=-0.503 4，P<0.000 1，圖1A~C）。檢測痰液標本也得到與組織標本相同的結果（圖1D~F）。

圖1 qRT-PCR檢測臨床標本中CASC7和miR-98-5p的表達Fig.1 Expressions of CASC7 and miR-98-5p in clinical specimens was detected by qRT-PCR

2.2 COPD大鼠模型評估通過HE染色觀察COPD大鼠的肺組織，評估建模情況。實驗觀察結果顯示，與正常大鼠肺組織相比，COPD大鼠的肺泡壁變厚，面積增大，血管增多，支氣管的管壁增厚，黏液腺增生，有大量炎癥細胞浸潤，纖毛倒伏，上皮結構紊亂。以上都符合COPD的特征，說明模型建立成功（圖2）。

圖2 HE染色結果（×200）Fig.2 HE staining results（×200）

2.3 COPD大鼠肺組織中CASC7表達降低，miR-98-5p表達增高，且PI3K通路被激活成功建立COPD大鼠模型后，檢測大鼠肺組織中RNA表達，結果發現，與健康大鼠相比，COPD大鼠中CASC7的表達降低，miR-98-5p表達升高（圖3A），且PI3K的mRNA與p-PI3K蛋白表達增高（圖3B~D），說明PI3K通路被激活（均P<0.05）。

圖3 肺組織中CASC7、miR-98-5p、PI3K表達水平Fig.3 Expressions of CASC7，miR-98-5p and PI3K in lung tissue

2.4 過表達CASC7能抑制COPD大鼠血清中炎癥因子表達在大鼠體內轉染了過表達CASC7的pcDNA3.1質粒，觀察CASC7對大鼠血清中炎癥因子的作用。ELISA結果表明，與對照組相比，過表達CASC7可抑制炎癥因子分泌（均P<0.05，表2）。

表2 ELISA法檢測IL-6、IL-8、TNF-α的表達水平（±s，pg/ml）Tab.2 IL-6，IL-8，TNF-α expression levels were detected by ELISA（±s，pg/ml）

表2 ELISA法檢測IL-6、IL-8、TNF-α的表達水平（±s，pg/ml）Tab.2 IL-6，IL-8，TNF-α expression levels were detected by ELISA（±s，pg/ml）

Note：Compared with pcDNA3.1，1）P<0.05.

Groups pcDNA3.1 pcDNA3.1-CASC7 IL-6 236.6±18.2 117.1±12.31）IL-8 107.0±8.0 36.0±2.01）TNF-α 37.0±2.0 11.0±5.01）

2.5 過表達CASC7可抑制BSMCs上清液中炎癥因子的分泌和BSMCs細胞增殖，誘導BSMCs凋亡ELISA結果顯示，與對照組相比，過表達CASC7可使炎癥因子分泌減少（均P<0.05，圖4A）；CCK8和流式細胞術顯示，與對照組相比，過表達CASC7可抑制BSMCs的增殖并誘導其凋亡（均P<0.05，圖4B~D）。

圖4 過表達CASC7對BSMCs的生物學作用Fig.4 Biological effects of CASC7 overexpression on BSMCs

2.6 CASC7作為miR-98-5p的分子海綿發揮作用通過亞細胞定位網站（http：//lncatlas.crg.eu/）和FISH實驗檢測出CASC7在細胞質中表達更高，說明CASC7可以作為ceRNA發揮功能（圖5A）；在lncRNASNP2（http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/lnc-RNASNP/#！/）中發現CASC7與miR-98-5p的結合位點（圖5B），在此基礎上本實驗進行了雙熒光素酶報告實驗驗證二者存在靶向關系（圖5C），CASC7可以作為miR-98-5p的分子海綿。

圖5 CASC7和miR-98-5p的靶向關系鑒定Fig.5 Identification of targeting relationship between CASC7 and miR-98-5p

2.7 miR-98-5p通過直接靶向SIRT3調控PI3K信號通路通過RNA22網站（https：//cm.jefferson.edu/rna22/）預測了miR-98-5p的下游靶基因SIRT3，并通過雙熒光素酶報告實驗證明miR-98-5p可靶向調控SIRT3（圖6A、B）。檢測SIRT3在臨床組織樣本中的表達水平發現，與非吸煙者的肺組織相比，非COPD吸煙者和COPD患者的肺組織中SIRT3表達降低，痰液標本檢測也得到相同結果（均P<0.05，圖6C、D）。經分析得出miR-98-5p與SIRT3的表達呈負相關（r=-0.883 7，P<0.000 1，圖6E）。Western blot檢測p-PI3K蛋白表達，結果發現，過表達miR-98-5p可明顯上調p-PI3K蛋白表達，抑制miR-98-5p表達則可下調p-PI3K蛋白表達（圖6F、G）。

圖6 miR-98-5p、SIRT3、PI3K關系驗證Fig.6 miR-98-5p，SIRT3，PI3K relationship verification

2.8 改變SIRT3可部分抑制CASC7或miR-98-5p對大鼠血清炎癥因子表達的影響與miR-98-5p in?hibitor+si-NC組 相 比，miR-98-5p inhibitor+si-SIRT3組IL-6、IL-8、TNF-α表達水平上升，說明沉默SIRT3可以部分抑制下調miR-98-5p對炎癥因子分泌的影響作用；與CASC7+si-NC組相比，CASC7+si-SIRT3組IL-6、IL-8、TNF-α表達水平均上升（均P<0.05，圖7），提示沉默SIRT3也可以部分挽救CASC7的作用。

圖7 ELISA法檢測IL-6、IL-8、TNF-α的表達水平Fig.7 Expression levels of IL-6，IL-8 and TNF-α were detected by ELISA

2.9 敲低SIRT3可以部分逆轉過表達CASC7或miR-98-5p抑制劑對BSMCs的作用ELISA結果發現，相較于miR-98-5p inhibitor+si-NC組，miR-98-5p inhibitor+si-SIRT3組各因子的表達均被促進（均P<0.05）；相較于CASC7+si-NC組，CASC7+si-SIRT3組IL-6、IL-8、TNF-α表達均上升（均P<0.05，圖8A~C）。CCK-8實驗結果顯示，較miR-98-5p inhibitor+si-NC組，miR-98-5p inhibitor+si-SIRT3組的細胞增殖能力增強（P<0.05），較CASC7+si-NC組，CASC7+si-SIRT3組的細胞增殖被促進（P<0.05，圖8D）。流式細胞術結果顯示，較miR-98-5p inhibitor+si-NC組，miR-98-5p inhibitor+si-SIRT3組的細胞凋亡率降低（P<0.05）；較CASC7+si-NC組，CASC7+si-SIRT3組的細胞凋亡率降低（P<0.05，圖8E）；Western blot結果顯示，與miR-98-5p inhibitor+si-NC組相比，miR-98-5p inhibitor+si-SIRT3組p-PI3K蛋白表達升高（P<0.05），與CASC7+si-NC組相比，CASC7+si-SIRT3組p-PI3K表達升高（P<0.05，圖8F）。提示si-SIRT3可以部分逆轉miR-98-5p inhibitor或CASC7對細胞產生的影響（圖8G）。

圖8 敲低SIRT3能影響過表達CASC7或miR-98-5p抑制劑對BSMCs的作用Fig.8 Knocking down SIRT3 could affect effect of overex?pressed CASC7 or miR-98-5p inhibitor on BSMCs

3 討論

本研究從分子生物學角度探究了CASC7在COPD進展中的作用，發現其能夠與miR-98-5p競爭性結合進而抑制SIRT3表達，改善COPD大鼠氣道炎癥反應及BSMCs增殖。

COPD發病的主要原因是氣道炎癥，且小氣道炎癥也是COPD的主要病變部位，該過程會使大量炎癥細胞浸出，同樣也會釋放大量IL-6、IL-8、TNF-α，導致氣流受限，最終還會引起肺纖維化［12-13］。中性粒細胞的增多是COPD的中心環節，IL-6可抑制中性粒細胞凋亡，推進中性粒細胞增殖，而IL-8與IL-6的分泌也具有相關性［14］。另外肺泡巨噬細胞在COPD中的增多也可間接導致肺組織損傷，肺泡巨噬細胞也促進了TNF-α的產生，TNF-α在肺氣腫的發生中占有重要地位［15］。氣道炎癥也會引起氣道管壁增厚，支氣管氣道平滑肌的增生肥大，從而導致氣道重構，氣道重構是COPD具有標志性的病理變化［16］。

本研究發現LncRNA CASC7在COPD中低表達，且過表達CASC7抑制了IL-6、IL-8、TNF-α的分泌，抑制BSMCs的增殖，誘導其凋亡，可見CASC7能夠對氣道炎癥起保護作用，并通過抑制BSMCs的增殖來抑制氣道管壁增厚現象。既往研究表明，LncRNA CASC7在肺癌中發揮抑癌因子作用［8］。此外，CASC7在哮喘中也發揮保護作用，能夠改善嚴重哮喘的進展［9］。本研究則進一步證實了CASC7在COPD進展中的影響及其保護功能。

很多研究證明LncRNAs作為miRNAs的分子海綿，調節細胞的多種發展過程。本研究利用生物學網站和FISH實驗驗證CASC7可以海綿吸附miR-98-5p。miR-98-5p在肺部疾病中的作用已被證實。MUSRI等［10］研究了COPD中多種miRNAs的異常表達，結果發現miR-98在COPD患者中上調。本課題組通過實驗也得到了在COPD中miR-98-5p表達上調的結論，還發現miR-98-5p與CASC7的表達呈負相關，在COPD中發揮促進疾病發展的作用。而后課題組又發現并驗證了miR-98-5p的下游靶基因SIRT3。SIRT3是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白去乙?；傅囊环N，存在于線粒體中，并在正常組織中廣泛表達，被認為是細胞保護性Sirtuin［17］。研究發現，SIRT3可誘導肺癌細胞的凋亡與壞死，也可抑制COPD氣道上皮線粒體氧化應激，改善細胞損傷［11，18］。另外一項研究顯示，COPD患者的外周血單個核細胞中SIRT1蛋白表達顯著降低［19］。本研究發現SIRT3在COPD中表達下調，并且可以被CASC7/miR-98-5p軸調控，過表達CASC7或miR-98-5p抑制劑對炎癥因子和BSMCs的抑制作用均可被沉默SIRT3反轉，SIRT3在COPD中發揮保護作用。

另外已有研究表明，SIRT3與人磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）信號通路相關，有研究表明人參皂苷Rg3和補肺益腎Ⅱ號方都能有效抑制PI3K活性，緩解COPD的癥狀［20-22］。本實驗驗證了miR-98-5p可以通過SIRT3影響PI3K活性，進而參與COPD的發展。

本研究從氣道炎癥和BSMCs的角度探討了CASC7在COPD中的生物學功能，可能為COPD的預防與治療發現了新的生物標志物，并提供了實驗依據。