糞菌移植對壞死性小腸結腸炎新生小鼠腸道菌Th1/Th2細胞因子表達的影響①

田亞麗 王芳 田東惠 周逢強

（濱州市人民醫院，濱州 256610）

新生兒壞死性小腸結腸炎（neonatal necrotizing enterocolitis，NEC）為臨床新生兒尤其是早產兒較為常見且嚴重的腸道炎癥疾病，主要表現為血便、腹脹及腸壁積氣等癥狀，其致病機制尚未完全明確［1］。近年研究表明，NEC發生與腸道菌群紊亂密切相關，早產兒腸道菌落種類和數量減少，尤其是益生菌減少，導致克雷伯菌屬處于相對優勢，可能是NEC發病機制中的重要因素［2-3］。糞菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）對復發性難辨梭菌芽孢桿菌性腸炎（clostfidium difficile infection，CDI）患者及潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）小鼠治療均有顯著療效，FMT預防及治療能夠顯著改善結腸炎引起的腸道菌群及炎癥因子改變，從而促進結腸黏膜修復［4-5］。因此，FMT是增加結腸炎患者腸道有益菌、改變腸道菌群結構紊亂、重建腸道內環境最直接的方式。為探討FMT對NEC的預防作用，本研究將建立NEC新生小鼠模型，探討FMT對NEC新生小鼠腸道菌群的影響，并分析具體機制，以期為NEC臨床治療提供新的方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物48只SPF級3日齡C57BL/6新生雌性小鼠，體質量1.5~3.0 g，購于山東省實驗動物中心，許可證號：SCXK（魯）2018-0012。

1.1.2 藥品與試劑雅培嬰幼兒奶粉購自美國雅培公司；HE染色試劑盒購自北京索萊寶公司；兔抗鼠Gata-3、T-bet抗體購自武漢博士德公司；小鼠IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α ELISA試劑盒購自美國R&D公司。

1.1.3 儀器CX-31顯微鏡購自日本Olympus公司產品；ELX-800酶標儀購自美國Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及建模48只C57BL/6新生小鼠置于保育箱，（36±1）℃，45%~60%相對濕度，經口插入PICC管，灌胃給予代乳品，每4 h喂養1次，0.03~0.05 ml/（g·次）。適應性喂養7 d，隨機分為對照組、NEC模型組、FMT預防組、FMT治療組，每組12只。除對照組外，其余三組均參照文獻［6］采用缺氧+冷刺激+人工喂養法連續刺激3 d建立NEC模型：新生小鼠放入自制密閉缺氧箱（100%N2）90 s，4℃冷刺激10 min，缺氧、冷刺激2 d/次，交叉進行。對照組幼鼠自由飲水6 d；FMT預防組在建立NEC模型同時灌胃給予FMT，飲水恢復3 d；FMT治療組建模成功后灌胃給予FMT，連續3 d。

1.2.2 FMT菌液制備實驗期間每日收集對照組小鼠3 h內新鮮糞便，混勻，稱重，加入生理鹽水制成400 mg/ml FMT混懸液，隨后按小鼠自身體質量1/500劑量給予FMT預防組及FMT治療組（80~120μl/只），同時實驗期間每天收集各組小鼠糞便，制備FMT菌液，-80℃保存用于菌群分析。

1.2.3 結腸組織病理學觀察實驗第7天處死各組小鼠，取出腸管（十二指腸下端至回盲部），于白色無菌紗布上肉眼觀察腸管是否有出血、壞死或無腸腔積氣等NEC樣病變。清除腸道內容物，取各組幼鼠腸組織（近回盲部1~2 cm），4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色，封片，光學顯微鏡下觀察腸組織病理學變化。

1.2.4 ELISA測定結腸組織細胞因子水平準確稱取各組小鼠結腸組織，參考文獻［7］制備結腸組織勻漿，加入預冷PBS緩沖液并超聲粉碎，4℃、3 000 g離心15 min，取上清，檢測炎癥因子含量，嚴格按照IL-4、IL-10、TNF-α及IFN-γ ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.5 免疫組化檢測結腸組織Gata-3和T-bet陽性細胞表達參考文獻［8］SP法檢測各組小鼠結腸組織Gata-3和T-bet陽性因子表達，加入一抗Gata-3（1∶100）、T-bet（1∶50）4℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育。已知陽性片為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗為陰性對照，細胞核或細胞質中出現黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞。每張片隨機選取3個無交叉視野，Olym-pusBX41顯微鏡拍照，Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件計算陽性細胞比例。

1.2.6 小鼠腸道菌群分析收集各組小鼠實驗期間糞便制備FMT菌液，-80℃保存。參考文獻［9］采用Illumina miseq platform測序平臺（Illumina公司）對實驗樣本進行小鼠糞便菌群測序（16 S rDNA），聚類分析和PCA分析等方法分析樣本屬水平上的菌群結構與數量。

1.3統計學分析采用SPSS20.0軟件進行統計學分析，計量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組新生小鼠體質量變化及生存情況建模前4組新生小鼠體質量差異無統計學意義（P>0.05）。建模結束時，模型組及FMT干預組小鼠體質量差異無統計學意義（P>0.05），但較正常對照組明顯降低（P<0.05）。正常對照組小鼠進食和排便均正常，精神狀態良好，未出現NEC癥狀，而模型組及FMT干預組均出現不同程度胃潴留、腹脹、活動減少等癥狀，模型組均出現黑便、血便等癥狀。建模7 d，FMT預防組和FMT治療組體質量差異無統計學意義，但較模型組明顯升高（P<0.05，表1）。

表1 各組小鼠體質量及生存率比較（±s）Tab.1 Comparison of body weight and survival rate of mice in each group（±s）

表1 各組小鼠體質量及生存率比較（±s）Tab.1 Comparison of body weight and survival rate of mice in each group（±s）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with NEC model，2）P<0.05.

Groups Control NEC model FMT prevention FMT treatment Body weight/g 0 d 6.22±0.65 6.17±0.43 6.23±0.94 6.15±0.76 3 d 7.24±1.21 5.65±0.451）5.76±0.611）5.81±0.661）7 d 8.15±0.84 5.14±0.381）6.43±0.491）2）6.39±0.511）2）Survival rate/%100 66.7 83.3 83.3

2.2 各組新生小鼠結腸組織形態及病理學改變正常對照組小鼠腸組織腸管色澤鮮嫩，彈性佳，呈淡黃色，無出血、積氣和水腫等；NEC模型組小鼠腸管呈黑紅色改變，彈性差，腸管有出血現象，明顯擴張有積氣，呈串珠樣改變；FMT預防組和FMT治療組小鼠腸組織均呈淺紅色，彈性尚可，腸管有輕度積氣及輕微出血現象（圖1）。HE染色病理學觀察顯示：對照組回腸部結構完整，隱窩結構規則，腺體排列規則，組織結構清楚，無炎癥細胞浸潤及潰瘍；NEC模型組回腸部隱窩數扭曲，融合減少，絨毛脫落消失，且有大量炎癥細胞浸潤；FMT預防組和FMT治療組小鼠結腸炎癥均明顯緩解，隱窩數增加，上皮較為完整，結腸黏膜呈愈合趨勢（圖2）。

圖1 各組新生小鼠腸管形態及結腸組織病理學變化（×200）Fig.1 General morphology of intestines and histopatho?logical changes in colon of newborn mice in each group（×200）

2.3 各組新生小鼠結腸組織細胞因子測定與對照組相比，NEC模型組及FMT預防、治療組細胞因子IL-4及IL-10水平明顯降低（P<0.05），TNF-α及IFN-γ水平明顯升高（P<0.05）。與NEC模型組相比，FMT預防組及治療組IL-4及IL-10水平明顯提高（P<0.05），TNF-α及IFN-γ水平明顯降低（P<0.05，圖2）。

圖2 各組小鼠結腸組織各細胞因子含量比較Fig.2 Comparison of cytokine content in colon tissue of mice in each group

2.4 各組新生小鼠結腸組織Gata-3和T-bet陽性細胞表達正常對照組小鼠結腸組織Gata-3和T-bet陽性細胞僅存在于黏膜上皮，固有層細胞存在少量浸潤，NEC模型組、FMT預防組、FMT治療組陽性細胞均不同程度增加，且浸潤明顯。與對照組相比，NEC模型組T-bet陽性細胞比例及T-bet/Gata-3明顯提高（P<0.05），Gata-3陽性細胞比例明顯降低（P<0.05）。與NEC模型組相比，FMT預防組及治療組T-bet陽性細胞比例及T-bet/Gata-3明顯降低（P<0.05），Gata-3陽性細胞比例明顯提高（P<0.05，圖3、表3）。

表3 各組小鼠結腸組織Gata-3和T-bet陽性細胞占比（±s）Tab.3 Proportion of Gata-3 and T-bet positive cells in colon tissue of mice in each group（±s）

表3 各組小鼠結腸組織Gata-3和T-bet陽性細胞占比（±s）Tab.3 Proportion of Gata-3 and T-bet positive cells in colon tissue of mice in each group（±s）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with NEC model，2）P<0.05.

Groups Control NEC model FMT prevention FMT treatment T-bet/%12.25±4.78 65.65±9.461）42.68±5.891）2）33.78±4.271）2）Gata-3/%33.35±6.68 10.54±2.321）18.39±4.481）2）22.78±5.711）2）T-bet/Gata-3 0.36±0.01 6.76±0.231）2.37±0.071）2）1.58±0.031）2）

圖3 各組新生小鼠結腸組織Gata-3和T-bet陽性細胞（×400）Fig.3 Gata-3 and T-bet positive cells in colon tissue of newborn mice in each group（×400）

2.5 各組新生小鼠腸道菌群分析NEC模型組小鼠乳桿菌屬明顯減少，擬桿菌屬和顫螺菌屬增加，建模7 d時，顫螺菌屬連續增加，擬桿菌屬含量下降，乳桿菌屬未見明顯改變。FMT預防組在建立NEC模型時菌群改變與NEC模型組變化趨勢相同，但建模7 d時擬桿菌屬及顫螺菌屬有所減少，Allo?baculum菌屬及乳桿菌屬占比有所提高。FMT治療組顫螺菌屬及擬桿菌屬降幅明顯，乳桿菌屬出現更明顯增加趨勢（圖4）。

圖4 各組新生小鼠建模前后腸道菌群分析Fig.4 Analysis of intestinal flora of each group of new?born mice before and after modeling

3 討論

NEC為新生兒常見危重癥，發病機制復雜，可能與新生兒腸道功能不全、腸黏膜功能受損及感染有關［10］。正常腸道黏膜屏障可有效防止多種有害物質穿過腸黏膜進入人體及血液，從而防止結腸炎的發生［11］。研究顯示，FMT對于調節結腸炎患者腸道菌群平衡、重建腸道微生態系統及恢復腸黏膜屏障有明顯療效，但對于新生兒NEC的治療未見報道［12］。本研究中結果顯示，NEC模型組小鼠一般生存情況、體質量和腸道大體形態、回盲腸組織病理學損傷等方面均明顯差于對照組，表明本研究模型建立成功。FMT干預組或FMT治療組均能明顯改善NEC誘導的體質量下降，兩組小鼠的一般生存情況良好，腸道大體形態及腸組織病理學損傷較輕微，表明FMT在NEC小鼠動物模型中具有明顯保護作用。

腸道微生態激發的免疫應答在NEC的發展和轉歸中有重要作用，抑制免疫反應介導的腸黏膜損傷可促進腸黏膜屏障恢復［11］。正常狀態下，腸道黏膜在Th1、Th2和Treg等不同CD4+T細胞亞群的協調下維持內環境穩態，結腸炎患者病變部位CD4+T細胞增殖和浸潤增加，其中Th1/Th2細胞平衡紊亂為重要表現。轉錄因子T-bet和Gata-3轉錄因子分別特異性表達于Th1和Th2細胞，因此T-bet和Gata-3是判斷Th1/Th2細胞增殖和浸潤程度的良好指標［13-14］。本研究結果顯示，正常對照組小鼠結腸組織的Th1/Th2平衡以Th2抗炎為主導，而NEC模型小鼠則以Th1促炎為主導。FMT預防或治療后T-bet陽性細胞浸潤明顯降低，Gata-3陽性細胞明顯增加，且以Th1細胞分泌為主的TNF-α、IFN-γ等促炎因子明顯減少，以Th2細胞分泌為主的IL-4、IL-10等抗炎因子明顯增加，且FMT治療組的效果優于FMT預防組。以上研究表明FMT干預可調節Th1/Th2平衡右移介導腸黏膜修復，改善腸道微生態環境。

腸道菌群平衡對維持小鼠腸黏膜免疫屏障功能具有重要作用，若腸道菌群失調便可激活腸道內多種免疫細胞，釋放大量炎癥介質因子，因此FMT干預對NEC抗炎和腸道黏膜修復作用與FMT調節腸道菌群平衡密不可分［15］。在本研究中，FMT治療組新生小鼠擬桿菌屬及乳桿菌屬明顯改變，產生短鏈脂肪酸的Allobaculum菌明顯增加，顫螺菌屬所占比例明顯降低。增加的乳桿菌可通過競爭性抑制作用有效抑制致病菌過度繁殖，進而維持腸道微生態平衡，并調節新生小鼠膽汁酸鹽活性影響脂質代謝，增加體質量，同時乳桿菌還可通過促進CD4+T細胞分泌IFN-γ和IL-2等抗炎因子進一步發揮抗炎作用［16-18］。短鏈脂肪酸對于維持結腸上皮細胞正常的形態和功能具有重要作用，人體腸道菌群中顫螺菌屬的水平高低與體質量呈負相關［19］。因此FMT干預后顫螺菌屬的減少可能與小鼠體質量增加有關。

因此，糞菌移植可有效調節NEC模型小鼠腸道菌群結構，減輕結腸炎癥損害，促進腸黏膜屏障功能恢復，可能與FMT干預后調節Th1/Th2平衡，下調炎癥因子表達，介導Th2免疫修復有關。