氯沙坦調節TLR4/NF-κB信號通路對腎血管性高血壓大鼠左心室重構的保護作用①

陳強 菅建國 張娟 陳麗珠

（內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院心內科，包頭 014010）

在過去十年中，全球死于心血管疾病的人數比以往增加了12.5%，現在因心血管疾病死亡的人數約占全球所有死亡人數的三分之一［1］。高血壓相關性左心室肥厚被認為是不良心血管事件的獨立危險因素，包括心律失常、心肌梗死、充血性心力衰竭、卒中和腎功能衰竭［2-3］。左心室肥厚不僅是后負荷增加引起的靶器官損害，也是最主要的心血管危險因素。及時治療和改善左心室肥厚、心力衰竭、缺血性心臟病和房顫能有效提高生存率［4-5］。另外，左心室肥厚還與多種非血流動力學因素有關，包括體重指數、年齡、腎素、醛固酮、血管緊張素、細胞內鈣、心房利鈉肽、血液黏度、動脈血管順應性等［6-7］。目前研究顯示氯沙坦（losartan，LOS）有減少心室重構和改善心室功能的作用，可以有效改善高血壓患者的炎癥因子，但是臨床療效及具體的作用機制仍存在爭議［8-9］。本研究通過觀察氯沙坦對腎血管性高血壓大鼠（RVH）心功能、心室重構和心肌纖維化的影響，進一步探討高血壓心臟病的病理機制，同時研究氯沙坦對高血壓大鼠心功能、心室重構和炎癥因子的干預機制。

1 材料與方法

1.1 材料SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，選取200~250 g、10~12周齡雄性SD大鼠。氯沙坦片（批號：20180902）購自杭州默沙東制藥有限公司；小動物彩色多普勒超聲診斷儀（富士2100）購自山東帕頓國際貿易有限公司；Masson染色試劑盒購自南京建成生物工程研究所；中性樹膠購自國藥集團化學試劑有限公司；大鼠CRP、TNF-α、IL-10 ELISA試劑盒購自上海賽默科技生物發展有限公司；大鼠IL-1、IL-6 ELISA試劑盒購自上海紀寧實業有限公司；兔抗TLR4（ab13556 1∶500）和兔抗NF-κB（ab131546 1∶500）抗體均購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；PVDF膜和ECL化學發光劑均購自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 腎血管性高血壓模型構建將45只雄性SD大鼠隨機分為：空白對照組、模型對照組（RVH）和氯沙坦干預組（RVH+LOS），每組各15只。所有動物實驗都嚴格遵守《實驗動物管理條例》。適應性喂養1周后，用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，將大鼠俯臥固定，背部皮膚脫毛后用碘伏棉球消毒，在第三腰椎棘突水平沿背后正中線做1個3~4 cm的切口，切開皮下組織和腰背筋膜，暴露左側腎動脈。先鈍性分離左腎動脈，將0.3 mm的“U”型鈦合金夾水平方向套在左腎動脈上，待左腎顏色變為淺紅色，取下鈦合金夾。同樣的方法在較左側開口高1 cm處做右側切口，分離結扎方法相同，手術視野內注入0.3 ml青霉素（8×104U/ml）。縫合消毒后肌內注射青霉素4×104U/只，連續用藥5 d。Sham組僅游離左、右腎動脈，不做結扎，其余操作均同模型組。每只大鼠用耳標號標記，術前1 d用無創尾部血壓計測量血壓作為大鼠的基礎血壓，術后4周測量血壓進行評估。每只大鼠選3次血壓測量值計算平均血壓，3次測量值差距不能超過5 mmHg。大鼠收縮壓較術前升高22.6 mmHg（3 kPa）即為造模成功［10］。

1.2.2 干預方案參照文獻［11］，造模第2天進行相關藥物干預，干預組分別進行氯沙坦5、10、20 mg/kg灌胃給藥（1次/d），給藥治療4周，空白對照組和模型對照組給予等量生理鹽水灌胃，最后1次給藥后禁食24 h，用多普勒超聲心動儀評估心功能。

1.2.3 多普勒超聲心動圖評價大鼠心臟功能多普勒超聲心動儀探頭型號MS250，檢測頻率為13~24 MHz。將大鼠麻醉，記錄大鼠左室舒張末期內徑（LVEDD）、左室收縮末期內徑（LVESD）和左心室短軸縮短率（LVFS），辛普森法測定左室射血分數LVEF。

1.2.4 心室/體質量指數測定記錄大鼠體質量后將大鼠處死，取出心臟。去除心外膜脂肪組織、大血管、心房和瓣膜等組織，用生理鹽水清洗干凈并用濾紙吸去多余水分。用電子天平稱取并記錄心臟重量（HW）、心室重量（VW）和左心室重量（LVW）。用心室重量除以大鼠體質量計算心室/體質量指數。

1.2.5 Masson染色觀察大鼠心肌膠原含量膠原容積分數（CVF）心臟組織用4%多聚甲醛固定，經脫水處理后石蠟包埋，做4μm的連續切片，烤片后常規脫蠟至水。根據染色試劑盒說明書，用Weigert鐵蘇木素染色5~10 min，酸性乙醇分化，再用Massson返藍液返藍，隨后用麗春紅品紅染色5 min，經磷鉬酸分化后，用苯胺藍染色1~2 min。分別經過80%乙醇、95%乙醇、2次無水乙醇30 s快速脫水，然后放在二甲苯中透明，取出切片在通風櫥晾干后用中性樹膠封片。顯微鏡下觀察被染成藍色的是膠原纖維，心肌組織染成紅色，胞核染成黑藍色。照片用Image pro plus 6.0軟件進行分析，心肌膠原容積分數（CVF）為膠原纖維染色面積占切片總面積的百分比。

1.2.6 ELISA測定血清炎癥因子用非抗凝注射器從腹主動脈取血4 ml，4℃、2 000 r/min離心10 min后，血清保存在-80℃冰箱，標本收集完全后，在室溫下解凍，根據ELISA試劑盒說明書通過ELISA法測定各組大鼠血漿中CRP、TNF-α、IL-6、IL-10的含量。

1.2.7 心肌組織TLR4及NF-κB的表達情況心肌組織在蛋白裂解液中研磨，冰上裂解20 min，4℃、12 000 r/min離心15 min。用BCA試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白加入上樣緩沖液金屬浴100℃煮5 min使其變性。將蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，置于4℃恒溫冰箱分別孵育兔抗TLR4（1∶500）和兔抗NF-κB（1∶500）抗體過夜，第二天孵育HRP標記的山羊抗兔二抗，然后用Bio-Rad凝膠成像系統進行化學發光顯影。結果用Image J軟件計算灰度值，β-actin為內參，分析TLR4和NF-κB的表達。

1.3 統計學處理數據用Graphpad 7.0進行繪圖，SPSS17.0軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，t檢驗進行兩組間比較，One-way ANOVA進行多組間比較，Western blot條帶灰度值用Image J軟件分析，數據使用單向方差分析（ANOVA）。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物基本情況實驗過程中RVH組大鼠死亡1只，其余兩組無死亡。RVH組建模成功，造模后第4周收縮壓比造模前升高59.97 mmHg；Sham組造模后第4周收縮壓升高10.53 mmHg；RVH+LOS（5、10、20 mg/kg）組造模后第四周收縮壓分別升高42.63 mmHg、35.49 mmHg和22.92 mmHg。低濃度LOS（5、10 mg/kg）對腎血管性高血壓大鼠的作用低于高濃度LOS（20 mg/kg），因此，后續研究LOS對腎血管性高血壓大鼠左心室重構的影響采用20 mg/kg LOS干預組（表1）。

表1 各組大鼠手術前后收縮壓比較（±s，mmH）Tab.1 Comparison of systolic blood pressure before and after operation in each group（±s，mmH）

表1 各組大鼠手術前后收縮壓比較（±s，mmH）Tab.1 Comparison of systolic blood pressure before and after operation in each group（±s，mmH）

Groups Blank control group（Sham）Model control group（RVH）Intervention group（LOS 5 mg/kg）Intervention group（LOS 10 mg/kg）Intervention group（LOS 20 mg/kg）1 d before operation 113.94±6.74 116.38±4.70 109.42±6.92 115.76±3.29 108.46±7.23 4 weeks after operation 124.47±7.28 176.35±7.32 152.05±7.14 151.25±5.16 131.38±6.19 Mean value of difference（postoperative-preoperative）10.53 59.97 42.63 35.49 22.92

2.2 3組大鼠心臟功能和心室重構指標彩色多普勒超聲儀檢測心功能指標。結果顯示，與Sham組相比，RVH組LVESD和LVEDD水平均顯著升高（P<0.05），LVFS、LVEF水平均顯著降低（P<0.05）。氯沙坦治療后與RVH組相比，氯沙坦干預組LVESD和LVEDD水平明顯下降（P<0.05），LVFS、LVEF水平明顯升高（P<0.05），見表2。與Sham組相比，RVH組心臟重量（HW）、心室重量（VW）、左心室重量（LVW）、左心室/體質量指數均顯著增加（P<0.05），而氯沙坦干預后上述指標明顯降低（P<0.05），見表3。

表2 氯沙坦對自發性高血壓大鼠心功能的影響（±s，n=15）Tab.2 Effect of losartan on cardiac function in spontaneously hypertensive rats（±s，n=15）

表2 氯沙坦對自發性高血壓大鼠心功能的影響（±s，n=15）Tab.2 Effect of losartan on cardiac function in spontaneously hypertensive rats（±s，n=15）

Note：Compared with Sham group，1）P<0.05；compared with RVH group，2）P<0.05.

Groups Blank control group（Sham）Model control group（RVH）Intervention group（RVH+LOS）LVESD/mm 58.12±1.53 72.24±0.881）64.54±0.612）LVEDD/mm 30.22±1.02 53.36±0.741）44.18±0.822）LVFS/%46.22±1.10 22.48±0.751）35.64±0.982）EF/%76.98±0.92 43.71±0.751）54.32±0.942）

表3 3組大鼠心室重構指標（±s，n=15）Tab.3 Ventricular remodeling index in three groups of rats（±s，n=15）

表3 3組大鼠心室重構指標（±s，n=15）Tab.3 Ventricular remodeling index in three groups of rats（±s，n=15）

Note：Compared with Sham group，1）P<0.05；compared with RVH group，2）P<0.05.

Groups Blank control group（Sham）Model control group（RVH）Intervention group（RVH+LOS）BW/g 242.31±3.32 238.20±3.54 240.52±4.53 HW/mg 242.32±3.32 1 053.05±14.991）994.53±8.732）VW/mg 441.21±4.89 503.83±11.851）467.04±6.892）LVW/mg 237.23±3.05 293.06±9.261）60.72±4.592）LVW/BW/（mg·g-1）0.98±0.02 1.24±0.131）1.09±0.042）

2.3 3組大鼠心肌膠原含量Masson染色結果用Image pro plus 6.0軟件計算膠原纖維染色面積占切片總面積的百分比（心肌膠原容積分數，CVF）。結果顯示，與Sham組CVF（5.46±0.68）相比，RVH組心肌膠原纖維明顯增多，CVF（14.66±0.45）明顯升高（P<0.01）。與RVH組相比，干預組心肌膠原纖維明顯減少，CVF（8.18±0.52）明顯降低（P<0.01），見圖1。

圖1 3組大鼠心肌組織的膠原容積分數Fig.1 Collagen volume fraction of myocardial tissue in three groups of rats

2.4 3組大鼠血液炎癥因子水平ELISA檢測3組大鼠血漿中CRP、IL-6、TNF-α、IL-10的含量。結果如圖2所示，與Sham組相比，RVH組血漿中CRP、IL-6、TNF-α的含量顯著上升（P<0.05），IL-10含量明顯降低（P<0.05）。與RVH組相比，RVH+LOS組血 漿中CRP、IL-6、TNF-α的 含量明 顯降低（P<0.05），IL-10含量明顯升高（P<0.05）。

圖2 3組大鼠血漿中CRP、IL-6、TNF-α、IL-10的含量Fig.2 Levels of CRP，IL-6，TNF-α and IL-10 in plasma of three groups of rats

2.5 3組大鼠心肌組織TLR4及NF-κB的表達情況Western blot檢測大鼠心肌組織中TLR4和NFκB的表達情況。結果顯示，與Sham組相比，RVH組TLR4表達明顯增加，NF-κB表達也明顯增加。而與RVH組相比，RVH+LOS組TLR4和NF-κB表達均下降（圖3）。

圖3 3組大鼠心肌組織中TLR4/NF-κB通路的激活Fig.3 Activation of TLR4/NF-κB pathway in myocardial tissue of three groups of rats

3 討論

高血壓可引起多種心臟有關的疾病，包括高血壓心臟病和阻塞性冠心病。高血壓性心臟病的定義是高血壓患者出現左室肥厚或左室收縮期和舒張期功能障礙及其臨床表現，如心律失常和有癥狀的心力衰竭［12］。在因全身高血壓而導致的壓力超負荷條件下，左室廣泛增長，導致左室肥厚，以維持心輸出量。心肌肥厚表現為纖維化、冠脈循環改變和心肌細胞凋亡，可導致心衰、心肌缺血和心律失常［13］。本研究用“兩腎兩夾”的方法構建大鼠腎血管性高血壓模型，誘導大鼠心室重構。彩色多普勒超聲心動圖結果顯示，腎血管性高血壓大鼠左室收縮末期直徑和左室舒張末期直徑都明顯增加，左室短軸縮短率和射血分數明顯降低。高血壓模型組大鼠心臟重量、心室和左心室重量較對照組都有所增加，左心室和體重指數明顯升高。結果表明腎血管性高血壓模型大鼠心臟結構發生改變并影響心臟功能。

慢性和持續性炎癥通路的激活在高血壓心臟病引起的心室重構中發揮重要作用。炎癥細胞因子可誘導心肌細胞肥大、心肌細胞凋亡和心肌纖維化等心室重構的表型［14］。心肌纖維化是指心肌間質中膠原纖維過度堆積，不同分型膠原比例失調，膠原纖維排列紊亂［15］。心肌膠原容積分數（CVF）是Masson染色后評價心肌間質纖維化程度的指標，高血壓模型組大鼠CVF比對照組明顯增加。研究表明，左室肥厚的高血壓患者同單純高血壓患者相比CRP和TNF-α水平升高。TNF-α是炎癥細胞因子，可以誘導心肌肥厚和心肌細胞凋亡。轉基因過表達TNF-α的小鼠隨年齡增長，心肌細胞肥大同時心肌間質纖維化加重［16］。相反，基因敲除TNF-α的小鼠主動脈縮窄術后心肌細胞肥大減輕和心肌膠原纖維沉積減輕并伴有心肌凋亡細胞減少［17］。IL-6可以降低心肌收縮功能和誘導細胞肥大、膠原沉積和纖維化的發展，體外實驗中IL-6可直接引起心肌成纖維細胞膠原合成的增加。在心肌纖維化過程中，IL-6作為促炎細胞因子可以促進心肌纖維化的發生［18］。單核細胞分泌的IL-10作為細胞因子合成抑制因子，抑制心肌纖維化的發展［19］。本研究與文獻報道一致，高血壓模型組大鼠血漿中炎癥因子CRP、TNF-α和IL-6水平明顯升高，抑炎因子IL-10水平明顯降低。結果提示，炎癥反應促進了心室重構的發展。

促炎因子IL-6和抑炎因子IL-10受核轉錄因子-κB（NF-κB）的調控［20］，因此推測腎血管性高血壓導致的心室重構的發生可能與NF-κB通路有關。Toll樣受體（TLRs）是存在于哺乳動物細胞表面的細胞跨膜蛋白受體，通過識別相應的高度保守的病原相關分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），在抵御外來微生物入侵的先天性免疫應答和觸發適應性免疫應答中發揮重要作用，并且通過TLRs信號通路來介導腫瘤的免疫治療［21-22］。其中TLR4是TLR家族中的最重要一員，TLR4與配體結合后可以激活一系列的信號轉導通路，其中包括絲裂原激活的蛋白激酶家族和NF-κB通路，進而上調一系列的炎癥因子，激活炎癥反應［23］。本研究結果顯示，與對照組相比，高血壓模型組心肌組織中TLR4和NF-κB蛋白表達均升高，提示TLR4/NF-κB信號通路被激活。

氯沙坦是一種具有抗高血壓活性的血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑。它被用于高血壓和心臟衰竭的管理［24-25］。目前的研究顯示氯沙坦有減少心室重構和改善心室功能的作用，但是臨床療效及具體的作用機制目仍存在爭議［26］。本研究觀察了氯沙坦對腎血管性高血壓大鼠（RVH）心室重構的影響，結果顯示，氯沙坦干預組腎血管性高血壓大鼠心功能得到了明顯改善，心臟結構變化程度和心肌纖維化程度也有所減輕；大鼠血漿中炎癥因子CRP、TNF-α和IL-6水平降低，抑炎因子IL-10水平升高；TLR4和NF-κB蛋白表達明顯低于高血壓模型組。上述結果表明，氯沙坦可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減輕高血壓大鼠的炎癥水平，從而改善左心室重構。但是，仍需要進一步證實TLR4/NF-κB通路抑制劑能否阻斷氯沙坦對腎血管性高血壓大鼠左心室重構的保護作用。

綜上所述，氯沙坦調節TLR4/NF-κB信號通路對腎血管性高血壓大鼠左心室重構具有保護作用，拓寬了臨床對高血壓左心室重構作用機制的認識，對防治高血壓左心室重構具有重要的理論和實際意義。