帕瑞昔布鈉對宮頸癌細胞COX-2/PGE2通路及細胞學行為的影響①

容鳳嬌 杜佳楠 蔣良 富徐夏

（三亞中心醫院麻醉科，三亞 572000）

宮頸癌是世界范圍內女性最常見的癌癥之一，且有80%都是在發展中國家，對女性健康造成了嚴重威脅［1］。病毒感染和環境因素是引起宮頸癌發生的主要因素，手術切除和放化療是治療宮頸癌的常用手段［2］。雖然對于宮頸癌的治療策略不斷發展和進步，但是仍然沒有顯著提高患者的生存率［3］。帕瑞昔布鈉是一種環氧化合酶-2（COX-2）特異性抑制劑，屬于鎮痛藥物，臨床上常用于中度或重度術后急性疼痛的治療，療效高且不良反應低，能夠減輕宮頸癌患者腹腔鏡手術后的術后疼痛，提高治愈率［4］。COX-2在不同類型的腫瘤細胞中常發生過表達，其下游因子前列腺素E2（PGE2）可促進癌細胞遷移和侵襲，抑制COX-2/PGE2/轉錄激活子3（STAT3）信號通路可抑制前列腺癌細胞上皮間質轉化（EMT）及相關基因的表達［5-6］。而帕瑞昔布鈉可以濃度依賴性的方式降低癌細胞存活率，在MG-63人骨肉瘤細胞系中可通過抑制細胞增殖，促進細胞壞死以達到抗腫瘤效果［7］。但是，帕瑞昔布鈉對宮頸癌細胞EMT及遷移侵襲能力的影響，目前尚未有報道。本研究以宮頸癌HeLa細胞為研究對象，通過檢測帕瑞昔布鈉在不同濃度和不同時間點對HeLa細胞存活率的影響，篩選出合適的濃度和時間點進行細胞行為學指標的檢測，旨在揭示帕瑞昔布鈉對宮頸癌HeLa細胞COX-2/PGE2通路及其EMT和遷移、侵襲能力的影響，為帕瑞昔布鈉用于宮頸癌患者的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株及藥品人宮頸癌細胞株HeLa（批號：TCHu187）購自中國科學院典型培養物保存委員會細胞庫；帕瑞昔布鈉（規格：40 mg，批號：20200219）購自瑞典法瑪西亞公司。

1.1.2 主要試劑及儀器胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶（批號：25300-057、25300-081）購自美國Gibco公司；DMEM/F12培養基（批號：SH30023K）購自美國Hyclone公司；Matrigel基質膠（批號：354471）和8 μm 24孔Transwell小室（批號：350619）購自美國Corning公司；碘化丙啶（PI）、磺酰羅丹明B（SRB）、GAPDH單克隆抗體和聚偏氟乙烯（PVDF）膜（批號：CD-100603G、CD-1007G、CD-1006L、CD-08193）購自美國Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號：39224）和ECL顯色試劑盒（批號：31007）購自北京中山金橋生物科技有限公司；96孔培養板（批號：B615006）購自上海生工生物工程有限公司；COX-2、PGE2、STAT3、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化STAT3（p-STAT3）、磷酸化AKT（p-AKT）、E-鈣黏蛋白（E-cad?herin）、波形蛋白（vimentin）、基質金屬蛋白酶2（MMP2）、基質金屬蛋白酶組織抑制劑2（TIMP2）單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記鼠抗人IgG二抗（批號：ab10940、ab14307、ab10225、ab26357、ab24771、ab50119、ab51276、ab60135、ab43107、ab57112、ab00317）購自美國Abcam公司。酶標儀（型號：Fax-20100）購自美國INStat公司；光學顯微鏡（型號：尼康SMZ745）購自上海普赫生物科技有限公司；全能型凝膠成像分析系統（型號：ChemiDoc-MP）購自山東三瑞科技有限公司；轉膜儀和電泳儀（型號：170-3940、Mini Protean 3）購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養HeLa細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，置于含5%CO2的恒溫培養箱中傳代培養。取對數生長期的HeLa細胞進行實驗。

1.2.2 SRB法檢測不同濃度帕瑞昔布鈉在不同時間上對細胞存活率的影響將對數生長期的HeLa細胞消化，制成細胞懸液，調整濃度為3×107~5×107個/ml，接種于96孔板中，每孔100 μl。培養24 h后，分別加入0、50、100、150、200、250、300μmol/L濃度的帕瑞昔布鈉，繼續培養24 h、48 h、72 h后，取出細胞，加入預冷后的50%三氯乙酸，至終濃度為10%，4℃條件下固定1 h，然后用去離子水沖洗5次，晾干，加入0.4%SRB染料染色10 min，0.1%醋酸洗5次，過夜晾干，最后加入150μl 1%Tris堿溶解，用酶標儀在570 nm波長下檢測吸光值（OD值），計算細胞存活率。每組各設6個平行實驗孔。細胞存活率（%）=（實驗組OD570nm-空白組OD570nm）/（對照組OD570nm-空白組OD570nm）×100%。空白組只加培養液，對照組藥物濃度為零。

1.2.3 Transwell小室法檢測細胞遷移能力取HeLa細胞，用不含FBS的DMEM/F12培養基，制成細胞懸液，調整細胞濃度為1×109個/ml，取100μl細胞懸液接種到Transwell小室上室，同時加入不同濃度帕瑞昔布鈉，下室加入600 μl含20%FBS的DMEM/F12培養基，37℃培養24 h后用棉簽頭擦掉小室內未遷移的細胞，下室膜上遷移過去的細胞用4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗3次，甲醇再固定15 min，0.1%結晶紫室溫染色40 min。用水沖洗多余的染液，晾干后，光學顯微鏡下，每組隨機選取9個視野拍照，用Image J軟件計數穿過微孔膜的細胞。實驗重復6次。

1.2.4 Transwell小室法檢測細胞侵襲能力取Matrigel基質膠，用預冷的DMEM/F12培養基按Matrigel基質膠∶培養基=1∶8的比例稀釋成工作液，然后取50 μl鋪于Transwell小室的上室，鋪膠后置于37℃恒溫培養箱過夜，待Matrigel基質膠凝固。取HeLa細胞，用不含FBS的DMEM/F12培養基，制成細胞懸液，調整細胞濃度為1.5×109個/ml，其余操作與1.2.3細胞遷移能力檢測實驗相同。實驗重復6次。

1.2.5 Western blot檢測細胞COX-2、PGE2、STAT3、AKT、p-STAT3、p-AKT、E-cadherin、vimentin、MMP2和TIMP2蛋白表達水平取即將長滿單層的HeLa細胞，加入不同濃度帕瑞昔布鈉，37℃培養24 h后，1 200 r/min離心5 min，收集細胞，PBS洗滌3次，加入RIPA裂解液，于冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min后取上清，使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕式轉移法轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，之后將PVDF膜置于1∶2 000濃度稀釋后的COX-2、PGE2、STAT3、AKT、p-STAT3、p-AKT、E-cadherin、vimentin、MMP2和TIMP2一抗中4℃過夜孵育，緩沖液沖洗后，加入含辣根過氧化物酶綴合的二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育2 h，用ECL顯色試劑盒顯色，凝膠成像儀拍照，以GAPDH為內參，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。實驗重復6次。

1.3 統計學分析本研究所得數據采用SPSS22.0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不用濃度帕瑞昔布鈉在不同時間點對HeLa細胞存活率的影響如表1所示，與0 μmol/L帕瑞昔布鈉處理相比，除50 μmol/L帕瑞昔布鈉處理和100 μmol/L處理24 h外，其余各時間點不同濃度的帕瑞昔布鈉對HeLa細胞存活均有顯著抑制作用（P<0.05），且呈濃度和時間依賴性。由于100μmol/L帕瑞昔布鈉處理24 h對HeLa細胞存活率的抑制與0 μmol/L帕瑞昔布鈉處理24 h差異無統計學意義（P>0.05），因此選擇最大濃度100μmol/L處理24 h進行后續實驗遂將后續實驗分別采用0 μmol/L、25μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L帕瑞昔布鈉處理HeLa細胞，24 h后檢測其細胞學行為。

表1 不同濃度帕瑞昔布鈉在不同時間點對HeLa細胞存活率的影響（±s，n=6，%）Tab.1 Effects of different concentrations of parecoxib sodium on survival rate of HeLa cells at different time points（±s，n=6，%）

表1 不同濃度帕瑞昔布鈉在不同時間點對HeLa細胞存活率的影響（±s，n=6，%）Tab.1 Effects of different concentrations of parecoxib sodium on survival rate of HeLa cells at different time points（±s，n=6，%）

Note：1）P<0.05 vs 0μmol/L.

Concentration 0μmol/L 50μmol/L 100μmol/L 150μmol/L 200μmol/L 250μmol/L 300μmol/L Cell survival rate 24 h 100 87.38±9.98 74.79±9.54 40.25±9.211）37.33±8.861）34.96±8.551）30.54±8.191）48 h 100 82.98±9.67 62.36±9.361）38.37±8.891）35.27±8.541）31.98±8.231）26.38±7.731）72 h 100 75.95±9.48 60.13±9.161）36.57±8.771）32.32±8.361）27.26±7.831）24.22±7.551）

2.2 帕瑞昔布鈉對HeLa細胞遷移和侵襲能力的影響與帕瑞昔布鈉0 μmol/L組相比，帕瑞昔布鈉25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L組HeLa細胞遷移和侵襲實驗穿膜細胞數依次減少（均P<0.05），呈劑量依賴性，即表示細胞遷移和侵襲能力依次降低。見表2和圖1。

圖1 各組HeLa細胞遷移和侵襲（結晶紫染色，×200）Fig.1 Migration and invasion of HeLa cells in each group（crystal violet staining，×200）

表2 帕瑞昔布鈉對HeLa細胞遷移和侵襲能力的影響（±s，n=6）Tab.2 Effect of parecoxib sodium on migration and inva?sion of HeLa cells（±s，n=6）

表2 帕瑞昔布鈉對HeLa細胞遷移和侵襲能力的影響（±s，n=6）Tab.2 Effect of parecoxib sodium on migration and inva?sion of HeLa cells（±s，n=6）

Note：1）P<0.05 vs parecoxib sodium 0 μmol/L group；2）P<0.05 vs parecoxib sodium 25μmol/L group；3）P<0.05 vs parecoxib sodium 50μmol/L group.

Groups Parecoxib sodium 0μmol/L Parecoxib sodium 25μmol/L Parecoxib sodium 50μmol/L Parecoxib sodium 100μmol/L Number of penetrating cells in migration test 264.83±27.52 207.91±21.391）166.73±17.851）2）71.29±10.351）2）3）Number of penetrating cells in invasion test 147.58±15.32 109.25±12.141）78.29±9.431）2）33.45±4.281）2）3）

2.3 帕瑞昔布鈉對HeLa細胞MMP2/TIMP2蛋白比值及E-cadherin、vimentin蛋白表達的影響與帕瑞昔布鈉0 μmol/L組相比，帕瑞昔布鈉25 μmol/L、50μmol/L、100μmol/L組HeLa細胞vimentin蛋白表達水平和MMP2/TIMP2蛋白比值依次降低，E-cad?herin蛋白表達水平依次升高（均P<0.05），呈劑量依賴性。見圖2、3。

圖2 各 組HeLa細 胞E-cadherin、vimentin、MMP2和TIMP2蛋白表達條帶圖Fig.2 Protein expression bands of E-cadherin，vimentin，MMP2 and TIMP2 in HeLa cells of each group

2.4 帕瑞昔布鈉對HeLa細胞COX-2、PGE2、p-STAT3、STAT3、p-AKT和AKT蛋白表達水平的影響與帕瑞昔布鈉0 μmol/L組相比，帕瑞昔布鈉25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L組HeLa細 胞COX-2、PGE2蛋白表達水平和STAT3、AKT磷酸化水平依次降低（均P<0.05），呈劑量依賴性。見圖4、5。

圖4 各 組HeLa細 胞COX-2、PGE2、p-STAT3、STAT3、p-AKT和AKT蛋白表達條帶圖Fig.4 Expression bands of COX-2，PGE2，p-STAT3，STAT3，p-AKT and AKT in HeLa cells of each group

圖3 帕瑞昔布鈉對HeLa細胞E-cadherin、vimentin、MMP2/TIMP2蛋白表達水平的影響Fig.3 Effect of parecoxib sodium on expression of E-cad?herin，vimentin and MMP2/TIMP2 in HeLa cells

圖5 帕瑞昔布鈉對HeLa細胞COX-2、PGE2、p-STAT3、STAT3、p-AKT和AKT蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of parecoxib sodium on expression of COX-2，PGE2，p-STAT3，STAT3，p-AKT and AKT in HeLa cells

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統中較為常見的腫瘤，惡性程度極高，癌細胞的遷移和侵襲是導致患者病情惡化，甚至死亡的原因［8］。宮頸癌復發率高，總體預后不理想［9］，尋找新的治療藥物和策略是研究熱點。

帕瑞昔布鈉是纈昔布的前藥，應用于創傷性和術后患者，避免阿片類藥物引起的副作用，在術后的多模式鎮痛和增強康復中發揮重要作用［10］。帕瑞昔布鈉可抑制乳腺癌患者的炎癥反應，改善患者的免疫功能，能有效增強膠質母細胞瘤的免疫治療效果，抑制其增殖、遷移和侵襲［11-12］。誘導HeLa細胞EMT，可促進細胞侵襲和遷移，細胞發生EMT后，上皮組織不再具有保護作用，上皮標記因子E-cad?herin表達量減少，同時間質標記因子vimentin表達量升高［13-14］。MMP2和TIMP2為遷移侵襲相關蛋白，MMP2蛋白表達水平的降低可抑制HeLa細胞的侵襲和遷移，TIMP2為MMP2抑制物，調控MMP2/TIMP2的平衡可起到抗肺癌細胞轉移的作用［15-16］。本研究采用宮頸癌HeLa細胞為研究對象，使用帕瑞昔布鈉處理HeLa細胞，發現帕瑞昔布鈉作用24、48、72 h后均可降低HeLa細胞存活率，25 μmol/L、50μmol/L、100μmol/L帕瑞昔布鈉作用24 h，可顯著降低其遷移侵襲能力、vimentin蛋白表達水平及MMP2/TIMP2蛋白比值，提高E-cadherin蛋白表達水平，提示帕瑞昔布鈉可降低HeLa細胞的EMT和遷移侵襲能力，但是否影響COX-2/PGE2通路，尚需進一步研究。

COX-2通路參與結腸癌細胞EMT發生，COX-2的上調可導致PGE2過度合成，而PEG2可通過顯著提高MMP2活性，增加癌細胞的侵襲和遷移，因此，降低COX-2表達，可通過減少PGE2的合成降低MMP-2活性，進而減弱癌細胞增殖、侵襲和遷移能力，促進癌細胞凋亡［17-19］。COX-2/PGE2/STAT3/AKT參與癌癥干細胞EMT，抑制STAT3和AKT磷酸化，可使細胞遷移能力受阻［20-21］。本研究發現，帕瑞昔布鈉能劑量依賴性地降低COX-2和PGE2蛋白表達水平及其下游因子STAT3和AKT磷酸化水平。另外，COX-2/PGE2通路參與婦科腫瘤發生及炎癥反應［22］。ZHANG等［23］研究發現青蒿琥酯能夠通過抑制COX-2的表達，降低宮頸癌細胞遷移和侵襲能力，從而達到抗宮頸癌細胞轉移的效果。結合本研究提示帕瑞昔布鈉亦可能通過抑制COX-2/PGE2通路，進而抑制HeLa細胞EMT及遷移侵襲能力。

綜上所述，帕瑞昔布鈉可劑量依賴性抑制宮頸癌HeLa細胞EMT和遷移侵襲能力，可能與抑制COX-2/PGE2通路有關，為臨床上使用帕瑞昔布鈉治療宮頸癌提供了理論依據，但是帕瑞昔布鈉對宮頸癌細胞行為學的作用機制十分復雜，尚需深入研究。