胰腺癌B7-H4與相關血清腫瘤標志物的預后價值研究①

嚴小甜 錢韻

（浙江大學醫學院附屬第二醫院檢驗科，杭州 310009）

隨著分子生物學和免疫學的不斷發展，血清腫瘤標志物在腫瘤的篩查、診斷、判斷預后和轉歸、評價療效和隨診等方面顯示出越來越重要的臨床應用價值。

胰腺癌作為一種侵襲性較高的惡性腫瘤，由于缺乏有效的早期診斷方法，導致大多患者確診時已處于中晚期，手術切除預后差。CA199是胰腺癌目前為止最具敏感性和特異性的腫瘤標志物，并已顯示出其在臨床輔助診斷中的作用，可普遍用于早期診斷、預后評估以及術后監測復發和轉移，但單一標志物的應用仍具有局限性［1-4］。因此，亟需尋求新的腫瘤標志物對胰腺癌進行早期診斷及預后評估。

以往的研究結果顯示，胰腺癌組織中B7-H4表達陽性率明顯高于非腫瘤患者胰腺組織，且胰腺癌組織中B7-H4的表達水平明顯高于對照組。同時，胰腺癌組織中B7-H4的表達水平與TNM分級、遠端轉移及分化顯著相關，此外，B7-H4表達水平可作為獨立的胰腺癌預后指標［5-6］。

因此，本研究旨在評估原發胰腺癌患者的腫瘤組織中B7-H4表達水平與術前血清CEA、CA199及CA242表達水平的相關性，探究各標志物在胰腺癌預后中的價值，以期方便快捷地對非手術患者以及術后患者進行有效的評估和監測。

1 資料與方法

1.1 資料本實驗共納入2011年1月至2014年12月在浙江大學醫學院附屬第二醫院確診為胰腺癌的188例患者。納入標準：①在2011年1月至2014年12月期間首次診斷為胰腺癌患者；②首次因胰腺癌行根治術或姑息術、且術后病理證實為胰腺導管腺癌患者；③經組織病理學或細胞學診斷為胰腺導管腺癌；④術前尚未進行輔助放化療或免疫治療；⑤患者近期未發生感染及自身免疫性疾病；⑥術前進行相關實驗室檢查。獲得的臨床數據包括患者信息、腫瘤分化、腫瘤分級和治療方法。所有組織樣本經甲醛固定，石蠟包埋后制成組織切片，并由兩名病理醫生通過蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色切片明確診斷。本研究遵守浙江大學醫學院附屬第二醫院醫學倫理。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色使用EnVisionTM兩步法（Dako，斯特魯普，丹麥）進行免疫組織化學染色。將石蠟包埋組織進行5μm連續切片并轉移到干燥免疫組化專用玻片，進行脫蠟、水化、封閉、磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次、羊血清封閉減少非特異性結合，最后將組織與兔抗B7-H4單克隆抗體4℃孵育過夜，隨后滴加相應二抗，蘇木素復染，乙醇脫水，中性樹脂封片。

1.2.2 組織B7-H4染色評分請兩位沒有接觸到患者臨床信息的病理醫生隨機選出5個400倍鏡下放大切片視野，進行分析評價，染色結果表明B7-H4高表達于腫瘤細胞質和細胞膜。以半定量方法［6］評估B7-H4的表達，其陽性細胞的比例計分如下：0分（≤5%）；1分（6%~25%）；2分（26%~50%）；3分（51%~75%）；4分（>75%）。染色強度評估如下：0分（無染色）；1分（弱染色，淡黃色）；2分（溫和的染色，黃棕色）；3分（強染色，深棕色）。染色積分=陽性比例×染色強度：0分（陰性）；1~4分（弱陽性）；5~8分（中度陽性）；9~12分（強陽性）。本實驗設定染色積分<9時，B7-H4為低表達；≥9時，B7-H4為高表達。

1.2.3 血清腫瘤標志物水平檢測收集188例胰腺患者手術前1周內靜脈血清標本，每份血清1 ml。采用電化學發光法檢測血清中CEA及CA199含量，采用流式熒光發光法檢測血清中CA242含量，檢測方法按試劑盒及儀器說明書進行。判斷標準：CEA≥5 ng/ml為 陽 性，CA199≥37 U/ml為 陽 性，CA242≥20 U/ml為陽性。

1.3 統計學分析數據采用SPSS17.0軟件統計分析，由單因素方差分析或獨立樣本t檢驗分析B7-H4的表達和臨床病理特點之間的關系。總生存期（overall survival，OS）的計算為胰腺癌的初診到患者死亡。采用Kaplan-Meier分析和Tarone-Ware檢驗分析患者生存期差異。相關性比較采用Pearson或Spearman檢驗。受試者工作特征（ROC）曲線分析B7-H4以及術前血清腫瘤標志物以及兩者聯合對胰腺癌患者預后預測的價值，曲線下面積（AUC）比較采用Z檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CEA、CA199及CA242表達水平與患者臨床特征的關系188例胰腺癌患者血清標本中，67例CEA陽性（≥5 ng/ml），121例CEA陰性（<5 ng/ml）；154例CA199陽性（≥37 U/ml），34例CA199陰性（<37 U/ml）；109例CA242陽 性（≥20 U/ml），79例CA242陰性（<20 U/ml）。

實驗結果表明，血清CEA水平與胰腺癌患者的TNM分期及遠端轉移有關，Ⅲ+Ⅳ期胰腺癌患者血清CEA水平顯著高于Ⅰ+Ⅱ期（P<0.05），有遠端轉移的胰腺癌患者血清CEA水平顯著高于沒有遠端轉移的患者水平（P<0.05）。血清CEA水平與胰腺癌患者的年齡、性別及淋巴結轉移無關（P>0.05）。血清CA199及CA242水平均與胰腺癌患者的年齡及遠端轉移有關，≥65歲的胰腺癌患者血清CA199及CA242水平顯著高于<65歲患者（P<0.05），有遠端轉移的胰腺癌患者血清CA199及CA242水平顯著高于沒有遠端轉移的患者水平（P<0.05）。血清CA199及CA242水平與胰腺癌患者的性別、TNM分期及淋巴結轉移無關（P>0.05，表1）。

表1 胰腺癌患者腫瘤標志物表達水平與患者臨床特征的關系Tab.1 Relationship between expression level of tumor markers and clinical characteristics in patients with pancreatic cancer

2.2 CEA、CA199及CA242表達水平與患者生存期的關系隨訪至2016年12月，本次回顧性分析的188例胰腺癌患者均已死亡。從Kaplan-Meier生存曲線看，CA199表達陰性組的生存曲線高于CA199陽性組，經Tarone-Ware檢驗有統計學意義（P=0.046，圖1）。CA199陽性患者OS為（9.10±0.66）個月（95%CI：7.81~10.39），CA199陰性患者OS為（12.70±2.77）個 月（95%CI：7.27~18.13）。CEA陽性患者OS為（10.00±1.29）個月（95%CI：7.48~12.52），CEA陰性患者OS為（9.90±0.70）個月（95%CI：8.54~11.27），差異無統計學意義（P>0.05）。CA242陽性患者OS為（9.10±0.48）個月（95%CI：8.17~10.03），CA242陰性患者OS為（10.80±1.24）個月（95%CI：8.36~13.24），差異無統計學意義（P>0.05，表2）。

表2 腫瘤標志物表達水平與患者OS的關系Tab.2 Relationship between expression level of tumor markers and patient OS

圖1 Kaplan-Meier生存曲線比較血清CA199水平與OS的關系Fig.1 Using Kaplan-Meier survival curve to compare relationship between serum CA199 level and OS

2.3 B7-H4與CEA、CA199及CA242表達水平之間的相關性經Pearson檢驗，胰腺癌患者腫瘤組織B7-H4表達水平（積分水平：5.10±2.98）與手術前血清CEA表達水平（23.46±161.00）呈顯著正相關（P<0.01），而 與 血 清CA199（1 974.70±3 651.36）及CA242（86.72±132.76）表達水平之間無顯著相關性（P>0.05）。經Spearman檢驗，胰腺癌患者腫瘤組織B7-H4表達陽性率與手術前血清CEA表達陽性率顯著相關（P<0.01），而與CA199及CA242表達陽性率無相關性（P>0.05，表3）。

表3 B7-H4與血清腫瘤標志物表達水平的Spearman相關性Tab.3 Spearman correlation between B7-H4 and serum tumor marker expression levels

2.4 B7-H4及血清腫瘤標志物對胰腺癌患者預后的預測價值胰腺癌患者B7-H4染色積分及術前血清腫瘤標志物濃度預測術后6個月生存期的ROC曲線見圖2，AUC見表4，統計學分析見表5。經Z檢驗，B7-H4染色積分的AUC（95%CI）為0.705（0.629~0.773），明顯高于CEA的0.508（0.429~0.586）和CA242的0.518（0.439~0.596），差異具有統計學意義（Z=2.726，Z=2.524；P<0.05）；而略高于CA199的0.577（0.498~0.653），差異無統計學意義（Z=1.812，P>0.05）。

由上述ROC曲線分析明確，B7-H4染色積分和CA199具有預測胰腺癌患者術后6個月生存期的價值。因此，同時分析了胰腺癌患者B7-H4染色積分聯合術前血清CA199預測術后6個月生存期的ROC曲線見圖2，AUC見表4，統計學分析見表5。經Z檢驗，B7-H4染色積分聯合術前血清CA199的AUC（95%CI）為0.717（0.646~0.782），明顯高于CA199，差異具有統計學意義（Z=2.275，P<0.05）；而比B7-H4染色積分略高，差異無統計學意義（Z=0.614，P>0.05）。

圖2 B7-H4及血清腫瘤標志物預測胰腺癌患者預后的ROC曲線Fig.2 ROC curve of B7-H4 and serum tumor markers in predicting prognosis of patients with pancreatic cancer

表4 B7-H4與血清腫瘤標志物預測胰腺癌患者預后的AUC面積對比Tab.4 Comparison of AUC area between B7-H4 and serum tumor markers in predicting prognosis of patients with pancreatic cancer

表5 B7-H4與血清腫瘤標志物預測胰腺癌患者預后的差異比較（P value，Z value）Tab.5 Comparison of B7-H4 and serum tumor markers in predicting prognosis of patients with pancreatic cancer（P value，Z value）

3 討論

胰腺癌作為消化道惡性度最高的腫瘤之一，具有高侵襲性、隱匿性及易復發轉移的特點［7］。因此，尋找有效的生物標志物用于評估胰腺癌切除患者預后顯得尤為重要。

血清CEA、CA199和CA242是檢測胰腺癌常用的血清標志物［4，8］。CEA屬于免疫球蛋白超家族成員，是消化道腫瘤最常用的腫瘤標志物之一［9］。CEA被廣泛用于輔助腫瘤的診斷及預后評估，特別是用于術后腫瘤復發轉移的監測，相比于血清CEA正常的患者，血清CEA異常患者的預后更差［10］。本研究發現胰腺癌患者術前血清CEA水平與胰腺癌TNM分期及遠端轉移相關。遺憾的是，本研究中并未發現術前CEA水平與胰腺癌患者術后生存期相關，這可能與CEA在胰腺癌診斷與預后評估中，其敏感性和特異性都較低有關，因此往往和其他腫瘤標志物聯合診斷［10］。

CA199是一種黏蛋白型糖類腫瘤標志物，不僅可用于胰腺癌的輔助診斷，也可用于胰腺癌預后判斷［11-12］。術后CA199正常或術前輕度升高（<100 U/ml）提示預后良好，而CA199血清水平術前>100 U/ml或術后>37 U/ml則與不良預后有關［13-14］。本研究發現胰腺癌患者術前血清CA199水平與胰腺癌患者遠端轉移及術后生存期有關，表明血清CA199可能具有預測胰腺癌細胞的生物學行為的作用及預測胰腺癌患者術后6個月生存期的價值。

CA242是一種唾液酸化鞘脂類抗原，存在于胰腺癌和結腸癌細胞中，且其表達水平不受膽管良性疾病、急性胰腺炎等病變影響，在胰腺癌的鑒別診斷中有著較佳的特異性［15-16］。胰腺癌患者血清CA242水平與病程進展有一定的平行相關性，CA242水平的升高被認為與腫瘤的肝轉移及預后密切相關［17］。本組資料顯示，胰腺癌患者術前血清CA242在預測肺癌轉移中具有一定價值，但無法預測患者術后生存期。

研究表明，胰腺癌的發生發展與許多免疫分子相關［17］。B7-H4是調控免疫細胞應答重要的負性共刺激分子，與腫瘤逃避免疫監視以及腫瘤生長、轉移和預后密切相關［18-19］。之前的研究發現B7-H4在中晚期胰腺癌中表達增高，在遠端轉移陽性組表達高于遠端轉移陰性組，提示與腫瘤進展與轉移有關［5］。這一結果說明，B7-H4可能在胰腺癌的生物學演進上扮演了重要角色，有作為胰腺癌惡性生物學行為標記的潛在價值。本研究發現，在預后方面，血清CA199和組織B7-H4可能具有重要的臨床價值。

本實驗還分析了胰腺癌組織B7-H4與術前血清CEA、CA199和CA242之間的關系。結果表明，組織中B7-H4作為評估胰腺癌患者術后生存期的價值優于CEA和CA242，B7-H4與CA199聯合預后的價值優于單獨CA199。總之，B7-H4與血清腫瘤標志物聯合檢測在胰腺癌的早期診斷及預后評估中具有重大的臨床意義，且檢測方便，減輕患者負擔，具有進一步推廣其臨床應用的價值［20］。

總之，本研究表明聯合檢測B7-H4/CA199對胰腺癌患者的預后具有潛在的指導意義。本研究也存在一定的局限性：首先，本研究為單中心回顧性研究，有待未來開展前瞻性研究加以證實；其次，本研究入組患者為術前檢測血清腫瘤標志物水平的患者，將未檢測術前血清標志物水平的患者排除在外，可能產生選擇偏倚，從而影響研究結果。