誘導性支氣管相關淋巴組織（iBALT）相關細胞因子CXCL13在AECOPD患者肺泡灌洗液中的變化及臨床意義①

蔡星璇 林嬌嬌 李年珍 岳雅麗 杜新 賈俊青

（山西醫科大學附屬汾陽醫院呼吸與危重癥醫學科，汾陽 032200）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmo?nary disease，COPD）是一種以氣流受限為特征，可預防、可治療的慢性氣道炎癥性疾病，是全球三大死亡原因之一［1］。慢性阻塞性肺疾病急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）是指COPD患者癥狀突然加重，甚至引發呼吸衰竭，是COPD病死率提高的主要原因。細菌定植則是AECOPD發病的主要誘因之一［1-2］。IL-6、IL-8和TNF-α屬于促炎因子，在急性炎癥早期顯著升高［3］。越來越多研究證實，COPD患者體內可檢測到低濃度IL-8、IL-6和TNF-α表達，且上述促炎因子在AECOPD患者中顯著升高［4-6］。表明炎癥反應在COPD發生及發展過程中至關重要。誘導性支氣管相關淋巴組織（inducible bronchus-associated lymphoid tissue，iBALT），即不同類型抗原刺激后，患者支氣管、肺血管旁以及肺實質中會產生以B細胞為主的淋巴濾泡，此外，還會產生T細胞、樹突狀細胞、濾泡樹突狀細胞等，共同組成異位淋巴組織，見圖1［7-10］。CXCL13可表達于B細胞、T細胞及濾泡樹突狀細胞表面，是誘導形成iBALT的重要分子［11-12］。研究發現，COPD小鼠模型中，中和CXCL13會破壞支氣管周圍和肺實質中已形成的淋巴濾泡［13］。因此，CXCL13參與iBALT形成以及結構的長期維持，且可作為反映iBALT發生及發展的指標之一［8，12-13］。

圖1 香煙煙霧暴露小鼠模型和COPD患者肺組織中iBALT病理學表現［8，10］Fig.1 Histopathology of iBALT in chronic cigarette smoke exposed to mice and lung tissues of patients with COPD［8，10］

急性細菌性肺炎患者IL-8、IL-6和TNF-α等促炎因子被激活，進一步誘導M1型巨噬細胞激活［9］。M1型巨噬細胞具有強大的細胞毒功能，可介導機體免疫細胞抑制促炎因子，有利于抵抗細菌感染［14］。COPD穩定期患者IL-10等抑炎因子抑制炎癥激活，但會引起MMP12（matrix metalloproteinase 12，MMP12）上調［8］。MMP12是M2型巨噬細胞極化的標志物，與肺氣腫相關［15］。研究發現，參與極化的M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞可促進iBALT形成［8-9］。綜上所述，急性炎癥期，iBALT啟動肺部保護性免疫反應，慢性炎癥期主要加劇肺部疾病惡化［8-9，13，16］。但iBALT對慢性炎癥性疾病伴有急性感染的作用機制尚未明確，因此，本文擬分析iBALT相關細胞因子CXCL13在AECOPD患者支氣管肺泡灌洗液（bron?choalveolar lavage fluid，BALF）中的變化及臨床意義，初步探討iBALT在AECOPD中的作用，明確iBALT在AECOPD治療中的價值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象選取2019年11月至2020年11月山西醫科大學附屬汾陽醫院呼吸與危重癥醫學科收治住院因細菌感染導致COPD急性發作的患者14例（AECOPD組），并選取同期急性細菌性肺炎患者24例（單純感染組）。所有研究對象按照中華醫學會呼吸病學分會《肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原體檢測中國專家共識（2017年版）》采集BALF［17］。納 入 標 準：①AECOPD組 患 者 均 符 合《2021 GOLD慢性阻塞性肺疾病全球倡議：COPD診斷、治療與預防全球策略》的診斷標準［1］；②所有患者均通過影像學及實驗室檢測，包括降鈣素原（procalcitonin，PCT）、白細胞（white blood cell，WBC）、中性粒細胞（neutrophil，NEU）或痰培養確認肺部存在細菌學感染證據。排除標準：①特殊菌群感染（結核、真菌）所致肺炎；②支原體、衣原體、病毒感染所致肺炎；③伴有心、肝、脾、腎等嚴重疾病者；④嚴重營養不良者；⑤自身免疫系統疾病者；⑥惡性腫瘤疾病者；⑦合并嚴重全身性疾病者；⑧存在精神障礙無法配合檢查者；⑨1周內有大咯血和不能耐受支氣管鏡檢查者。本研究經山西醫科大學附屬汾陽醫院臨床倫理委員會批準，所有患者及家屬知情同意。

1.1.2 主要儀器與試劑纖維支氣管鏡（日本富士公司）；2700全自動生化分析（日本奧林巴斯）；移液槍（德國Eppenbof公司）；低速離心機（B320型，長沙湘儀離心儀器有限公司）；流式管（美國Falcon公司）；顯微鏡（日本Nikon）；CXCL13、IL-8、IL-6及TNF-α ELISA試劑盒（聯科生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 血清降鈣素原、白細胞及中性粒細胞水平檢測采集患者入院后空腹8 h肘靜脈血5 ml，電化學發光分析儀檢測血清PCT、WBC及NEU水平。

1.2.2 BALF采集所有研究對象按照中華醫學會呼吸病學分會制定的《肺部感染性疾病支氣管肺泡灌洗病原體檢測中國專家共識（2017年版）》進行支氣管肺泡灌洗［17］。采集AECOPD組及單純感染組患者BALF，根據肺部CT表現及纖維支氣管鏡下表現，選取存在感染表現的肺段作為灌洗部位，灌洗的肺段經活檢孔注入1~2 ml 2%利多卡因進行局部麻醉。楔入纖維支氣管鏡，經活檢孔通過硅膠管快速分次注入37℃滅菌生理鹽水（約100 ml，20~30 ml/次），立即用100 mmHg負壓吸引回收灌洗液，回收率>40%入組，立即用無菌紗布過濾回收的灌洗液，離心（4℃、1 200 r/min、10 min），收集上清，-80℃儲存待測。

1.2.3 BALF中細胞因子檢測采用ELISA試劑盒測定BALF上清中CXCL13、TNF-α、IL-6和IL-8水平，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.3 統計學處理采用SPSS26.0軟件進行統計學分析，Graphad Prism 8和Photoshop軟件作圖。Shapiro-Wilk檢驗分析各項指標正態分布情況，計量資料采用P50［P25，P75］表示，計數資料采用例數（n）及率（%）表示。組間比較采用Mean-WhitneyU秩合檢驗，組內兩計量指標相關性分析采用Spearman秩相關分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AECOPD組和單純感染組一般資料比較AECOPD組和單純感染組一般資料比較結果顯示，兩組患者年齡、性別及吸煙差異均無統計學意義（P>0.05），資料具有可比性。AECOPD組WBC、NEU水平高于單純感染組，PCT水平低于單純感染組（P<0.05，表1）。

表1 AECOPD組和單純感染組一般資料比較［例（%）］Tab.1 Baseline characteristics of patients in AECOPD and Lung Infection groups［n（%）］

2.2 兩組患者BALF中CXCL13、IL-8、TNF-α和IL-6水平比較與單純感染組相比，AECOPD組BALF中CXCL13［5.72（4.32，7.40）pg/ml vs 4.17（3.22，5.09）pg/ml，P=0.016］、IL-6［8.19（4.90，13.70）pg/mlvs 3.55（3.45，6.53）pg/ml，P=0.008］、IL-8［121.99（77.13，231.07）pg/ml vs 89.89（52.64，123.69）pg/ml，P=0.082］、TNF-α［1.46（1.30，1.67）pg/ml vs 1.34（0.67，1.69）pg/ml，P=0.201］均顯著升高，其中IL-8、TNF-α差異無統計學意義（P<0.05，圖2）。

2.3 兩組患者BALF中CXCL13與IL-8、TNF-α和IL-6相關性分析AECOPD組和單純感染組BALF中CXCL13與IL-8、TNF-α和IL-6相關性分析結果顯示，AECOPD組CXCL13與IL-8、TNF-α、IL-6呈負相關，但與IL-6差異無統計學意義（P>0.05）。單純感染組CXCL13與IL-8、TNF-α也呈負相關，但與IL-6差異無統計學意義（P>0.05，圖3）。

3 討論

COPD的高發病率和高病死率給全球造成了巨大經濟負擔和社會負擔，由于世界人口老齡化等因素，COPD造成的經濟負擔和社會負擔在未來幾十年將持續增加［1］。AECOPD可加快疾病進展，包括肺功能加速下降、生活質量嚴重受損和病死率提高，因此AECOPD防治是控制COPD惡化的關鍵要素之一［2］。CRISAFULLI等［4］發現因細菌感染導致AECOPD的患者（n=241）血液中IL-6、IL-8以及TNF-α水平均高于肺部細菌感染患者（n=41）。本研究顯示，與單純肺部感染組相比，AECOPD組IL-6［8.19（4.90，13.70）pg/ml vs 3.55（3.45，6.53）pg/ml，P=0.008］、IL-8［121.99（77.13，231.07）pg/ml vs 89.89（52.64，123.69）pg/ml，P=0.082］以及TNF-α［1.46（1.30，1.67）pg/ml vs 1.34（0.67，1.69）pg/ml，P=0.201］水平升高，與CRISAFULLI等［4］結果一致。此外，研究已證實急性炎癥和慢性炎癥中均有iBALT陽性表達，量化iBALT面積后發現，CXCL13與iBALT面積呈正相關［12-13］。本研究發現，慢性炎癥性疾病伴有急性感染（AECOPD）患者CXCL13濃度顯著高于急性細菌性肺炎患者［5.72（4.32，7.40）pg/ml vs 4.17（3.22，5.09）pg/ml，P=0.016］，提示慢性炎癥急性發作時伴有iBALT面積增加。

不同病原體感染的急性肺部感染小鼠模型中發現，小鼠細支氣管及血管周圍均有iBALT形成，且iBALT面積與小鼠模型中病原體滴度呈正相關。隨著病原體滴度下降，仍可觀察到iBALT結構，當小鼠體內檢測不到病原體滴度時，iBALT面積逐漸減少［9-18］。結 合SHAPOURI-MOGHADDAM等［14］及ZHANG等［19］對iBALT和巨噬細胞極化的相關性研究結論可推測，急性細菌性肺炎患者中，iBALT可能有利于抵御細菌感染。CXCL13作為iBALT的標志物，可通過CXCL13與促炎因子間的關系間接反映iBALT對病原體的作用。本研究發現，單純肺部感染組CXCL13與促炎因子IL-8（r=-0.789，P<0.001）、TNF-α（r=-0.480，P=0.018）、IL-6（r=-0.280，P=0.171）呈負相關，證實iBALT在急性炎癥期可抵御細菌感染。目前慢性炎癥性疾病伴有急性細菌感染患者中iBALT的作用尚未涉及。本研究證實，AECOPD組CXCL13與IL-8（r=-0.925，P<0.001）、TNF-α（r=-0.886，P<0.001）、IL-6（r=-0.525，P=0.054）呈負相關，與單純肺部感染組結果一致。因此推測慢性炎癥性疾病伴有急性細菌感染患者中，iBALT也可能有利于抵御細菌感染。

雖然AECOPD組和急性細菌性肺炎組CXCL13與IL-6均呈負相關，但無統計學意義（P>0.05），可能 與IL-6可 促 進iBALT形 成 有 關［20］。BOTELHO等［21］證實，小鼠肺組織中IL-6表達可誘導并激活B細胞，有利于促進iBALT形成。此外，本實驗收集的為患者支氣管肺泡灌洗液，一定程度上限制了本研究樣本量。目前研究認為痰誘導與支氣管肺泡灌洗液結果一致，且痰誘導適應證廣泛、禁忌證較少，因此未來可通過痰誘導收集患者痰液標本，進一步擴大樣本量，以證實CXCL13與促炎因子的相關性［22］。

綜上所述，慢性炎癥性疾病伴有急性感染（AECOPD）患者CXCL13濃度顯著高于單純急性感染患者。此外，本研究發現AECOPD患者與iBALT相關細胞因子CXCL13和促炎因子（IL-8、IL-6和TNF-α）呈負相關，與急性細菌性肺炎患者結果一致，提示iBALT在慢性炎癥性疾病伴有急性感染的患者中也可能有利于抵御細菌的感染，對AECOPD患者精準化治療具有重要意義。