雙葛止瀉口服液抑菌劑用量篩選與抑菌效力研究

李煥娟，桑卡娜，周 冰，楊絨娟，潘貴珍，周德剛

(洛陽惠中獸藥有限公司，國家獸用藥品工程技術研究中心，河南洛陽 471003)

雙葛止瀉口服液由金銀花、葛根等經提取、濃縮、純化及制劑成型而成的中藥口服溶液，功能清熱燥濕，解毒止瀉，用于仔豬濕熱泄瀉，實驗室研究其具有止瀉、抗炎的作用。在獸藥生產、貯藏和使用過程中，為防止雙葛止瀉口服液中微生物生長繁殖，需要加入適宜的抑菌劑用以增加抑菌作用。抑菌劑是指抑制微生物生長的化學物質，有時也稱防腐劑[1]。在口服制劑中，苯甲酸鈉因其對酵母、霉菌和部分細菌都有較好的抑制作用而被廣泛應用[2-3]，其用量范圍一般為0.1%～0.5%[4]。由于抑菌劑都具有一定的毒性，制劑中抑菌劑的量應為最低有效量[1]。

抑菌劑的抑菌有效性主要是通過抑菌效力檢查法進行測定的。抑菌效力檢查是對供試品中微生物的存活情況的動態監測過程。既要研究供試品被微生物污染后在短時間內抑菌劑對大量入侵微生物的抑制或殺滅的情況，又要研究隨著時間的推移微生物對周圍環境產生耐受或抑菌劑的穩定性發生改變后，供試品中微生物的總量是否仍能夠被控制在合理范圍內。

本研究依據《中國獸藥典》2015年版一部附錄“1121抑菌效力檢查法”的要求，對雙葛止瀉口服液中的抑菌劑用量進行篩選，用以確定抑菌劑的最低有效用量。參考《中國獸藥典》2015年版二部附錄“1102非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法”和附錄“1104非無菌獸藥微生物限度標準”進行微生物計數方法適用性研究，確定供試品合適的微生物計數方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器 YP10002型電子天平，金諾天平儀器有限公司；YXQ-LS-100A型全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；電熱恒溫水浴鍋，型號SSW-420-2S，上海博訊實業有限公司；電熱恒溫培養箱，型號DNP-9272BS-Ⅲ，上海新苗醫療器械制造有限公司；雙人超凈工作臺，型號SW-CJ-2FD，上海博訊實業有限公司；集菌儀，型號HTY-602，浙江泰林生物技術股份有限公司；微量移液器，規格100 μL、1000 μL、5 mL，德國Eppendorf公司；

1.1.2 培養基及稀釋液 胰酪大豆蛋白胨液體培養基，批號20170116；胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養基，批號20161018；沙氏葡萄糖瓊脂培養基，批號20160924；沙氏葡萄糖液體培養基，批號20160224；pH值7.0 氯化鈉蛋白胨緩沖液，批號20160321；均購自青島高科園海博生物技術有限公司。培養基適用性檢查符合《中國獸藥典》2015年版要求。

1.1.3 菌種 金黃色葡萄球菌〔CMCC(B) 26003〕、銅綠假單胞菌〔CMCC(B) 10104〕、大腸埃希菌〔CMCC(B) 44102〕、白色念珠菌〔CMCC(F) 98001〕、黑曲霉菌〔CMCC(F) 98003〕，購自中國食品藥品檢定研究院醫學菌種保藏中心。

1.1.4 試藥 雙葛止瀉口服液，規格：每1 mL相當于原生藥0.45 g，250 mL/瓶。按照雙葛止瀉口服液制備工藝制備苯甲酸鈉含量分別為0.1%、0.2%、0.3%和0.5%的樣品。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液的制備 取經35 ℃培養24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及大腸埃希菌的胰酪大豆胨瓊脂斜面培養物適量，另取經25 ℃培養48 h的白色念珠菌的沙氏葡萄糖瓊脂培養基斜面培養物適量，加入適量的無菌0.9%氯化鈉溶液，制成含菌數約為107～108CFU/mL的菌懸液(用于抑菌效力檢查)。取上述菌懸液用無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋成含菌數約為50～100 CFU/mL的菌懸液(用于微生物計數方法適應性研究)。取經25 ℃培養7 d的黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂培養基斜面培養物，加入5 mL含0.05%(V∶V)聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液，洗下孢子，制成含孢子數約為107～108CFU/mL的孢子懸液(用于抑菌效力檢查)。取上述孢子懸液用含0.05%(V∶V)聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液稀釋成含孢子數約為50～100 CFU/mL的孢子懸液(用于微生物計數方法適應性研究)。

1.2.2 微生物計數方法適用性研究 考慮到抑菌劑苯甲酸鈉具較強的抗菌活性，因此，在細菌計數試驗時應采用薄膜過濾法去除其抑菌活性；由于抑菌劑的濃度與抑菌效果成正相關，故本研究以最大添加抑菌劑0.5%苯甲酸鈉的供試品進行方法適用性研究，以保證所有濃度抑菌劑供試品微生物計數方法均能符合要求。

1.2.2.1 供試液的制備 取苯甲酸鈉含量為0.5%的雙葛止瀉口服液供試品10 mL至無菌玻璃瓶中，分別加入90 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，充分混合，制成1∶10(V∶V)的供試液。

1.2.2.2 計數方法適用性試驗方法(薄膜過濾法)

分別按以下方法對5種試驗菌株進行計數方法適用性試驗。

試驗組：用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，潤濕濾膜后(水膜)，取供試液1 mL加入100 mL pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中混勻，加入薄膜過濾器的濾筒中過濾，用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL，最后一次沖洗時，沖洗液中加入50～100 CFU/mL的試驗菌1 mL，搖勻后，濾過濾膜。

供試品對照組：用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，潤濕濾膜后(水膜)，取供試液1 mL加入100 mL pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中混勻，加入薄膜過濾器的濾筒中過濾，用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL。

菌液對照組：用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，潤濕濾膜后(水膜)，用100 mL pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液過濾，再用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL，最后一次沖洗時，沖洗液中加入50～100 CFU /mL的試驗菌1 mL，搖勻后，濾過濾膜。

陰性對照組：用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，潤濕濾膜后(水膜)，用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL。

過濾完成后將濾膜取出，將濾膜的菌面朝上貼于瓊脂平板上。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌制備的濾膜貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基，35 ℃培養3 d，計數。白色念珠菌和黑曲霉平行制備2份濾膜，一份貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基，35 ℃培養5 d，計數；另一份貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，25 ℃培養5 d，計數。

1.2.3 抑菌效力測定方法

1.2.3.1 供試品制備 取包裝完整的苯甲酸鈉含量分別為0.1%、0.2%、0.3%和0.5%的雙葛止瀉口服液供試品各10 mL至無菌玻璃瓶中，分別加入90 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，充分混合，制成1∶10(V∶V)的供試液。

1.2.3.2 供試品接種 取“1.2.1”項下制成的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及大腸埃希菌的菌懸液(含菌數約為107～108CFU/mL)及孢子懸液(含孢子數約為107～108CFU/mL)，分別取0.1 mL試驗菌于上述4份供試液中，每一容器接種一種試驗菌，充分混合，使供試液中的試驗菌均勻分布，置25 ℃培養箱中，避光貯存。

1.2.3.3 存活菌數測定 根據《中國獸藥典》2015年版一部附錄“1121抑菌效力檢查法”中表2-表3的規定，在供試品接種0 h、14 d、28 d時，分別從上述每個供試品容器中取供試品1 mL，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成1∶10、1∶102、1∶103等稀釋級，測定每份供試品中所含的菌數。其中測定方法依據1.2.2.2方法適用性試驗驗證合格的方法(薄膜過濾法)進行供試品中微生物計數。

1.2.3.4 抑菌效力判斷標準 內服制劑的抑菌效力判斷標準見表1。表中“減少的lg值”是指各間隔時間測定的菌落lg值與1 mL供試品中接種的菌數lg值的差值。

表1 內服制劑的抑菌效力判斷標準

2 結果與分析

2.1 方法適用性試驗結果 根據《中國獸藥典》2015年版二部要求，方法適用性檢查各試驗菌的回收率不得低于70%。試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值計算回收率，結果見表2。

表2 計數方法適用性試驗結果

2.2 抑菌效力測定結果 抑菌效力測定結果見表3。參考內服制劑的抑菌效力判斷標準，雙葛止瀉口服液中苯甲酸鈉含量為0.1%時，對白色念珠菌的抑制作用在間隔14 d和28 d均減少了0.7 lg，未達到藥典規定的至少降低1 lg的標準；雙葛止瀉口服液中苯甲酸鈉含量為0.2%時，對白色念珠菌的抑制作用在間隔14 d和28 d均減少了0.9 lg，未達到藥典規定的至少降低1 lg的標準；雙葛止瀉口服液中苯甲酸鈉含量為0.3%和0.5%時，對細菌和真菌的抑菌效力均達到了《中國獸藥典》2015年版的抑菌效力判定標準。

表3 接種后0 h細菌計數結果(CFU/mL)

表4 接種后14 d細菌計數結果(CFU/mL)

表5 接種后28 d細菌計數結果(CFU/mL)

3 討論與結論

3.1 抑菌劑用量篩選方法選擇的依據 雙葛止瀉口服液為非無菌制劑，在制劑中添加適宜的抑菌劑，用以防止制劑在正常貯藏或使用過程中由于微生物的生長繁殖影響藥物質量。抑菌效力檢査法是篩選抑菌劑用量的有效方法，可用于測定無菌及非無菌制劑的抑菌活性，用于指導研發階段制劑中抑菌劑用量的確定[5-10]，因此本研究采用抑菌效力檢查法篩選抑菌劑的用量。

3.2 抑菌劑用量篩選的重要性 抑菌劑用量的篩選非常重要，抑菌劑添加量過少，會使微生物生產繁殖從而引起污染，抑菌劑添加量過多，會引起不適或過敏等變態反應。理想的抑菌劑應作用迅速，其應在使用濃度范圍內安全無毒，與制劑中其他成分和包裝材料相容性良好[11-12]。由于苯甲酸鈉價格便宜，被廣泛用于食品、制藥行業[4]，雙葛止瀉口服液擬用于仔豬腹瀉，考慮到經濟動物使用成本因素，因此選擇苯甲酸鈉作為雙葛止瀉口服液的抑菌劑。苯甲酸鈉防腐作用依靠苯甲酸未解離分子，因此，pH值對其抑菌效果影響較大，雙葛止瀉口服液為弱酸性液體，因此選用苯甲酸鈉作為防腐劑是合理的。按照《中國獸藥典》2015年版一部附錄“1121抑菌效力檢查法”內服制劑抑菌劑效力判斷標準，雙葛止瀉口服液中苯甲酸鈉含量為0.3%和0.5%時，均能滿足抑菌劑效力試驗要求，但根據最小有效量添加的原則，確定雙葛止瀉口服液中苯甲酸鈉含量為0.3%，本結果與同類中藥口服液體制劑考察結果基本一致[9]。

表6 含不同用量苯甲酸鈉的雙葛止瀉口服液樣品抑菌效力檢查結果

3.3 結論 綜上，根據《中國獸藥典》2015年版一部附錄“1121抑菌效力檢查法”的要求，0.3%的苯甲酸鈉可作為雙葛止瀉口服液的抑菌劑用量。