固體脂質納米增強抗菌藥物對胞內金黃色葡萄球菌活性的研究進展

李露萍，楊雨婷，張雪花，程古月，謝書宇

(華中農業大學國家獸藥殘留基準實驗室(HZAU)，國家獸藥安全評價實驗室(HZAU)，農業部畜禽產品質量安全風險評估實驗室，武漢 430070)

金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要病原體之一，對大多數國家的奶業生產造成了巨大的經濟損失。原料乳中存在的金黃色葡萄球菌也是貫穿整個食物鏈的公共衛生問題。奶牛乳腺炎在我國的發病率為20%～70%左右，其中隱性乳腺炎的發病率高達50%[1]，以金黃色葡萄球菌奶牛乳腺炎的發病率和危害最為嚴重。很多證據表明，金黃色葡萄球菌可以在細胞內存活，諸如乳腺上皮細胞和巨噬細胞，使其能夠逃避免疫識別，避免與抗生素接觸，導致奶牛乳腺炎長期發病且反復感染[2]。金黃色葡萄球菌被吞噬細胞吞噬后，被包含在吞噬體內，通過宿主多種抗菌防御機制而被大量的清除。盡管大多數金黃色葡萄球菌被吞噬細胞清除，但因金黃色葡萄球菌具有通過調節其內體微環境而在吞噬過程中存活的能力，而仍然有部分細菌能在細胞內存活[3]。金黃色葡萄球菌也可通過內體逃逸來抵御吞噬溶酶體惡劣環境的殺滅作用。相比于志賀氏菌、李斯特菌和立克次氏體在侵入后幾分鐘內即分泌破壞膜的毒力因子從吞噬體逃逸到宿主細胞胞質中[4]，金黃色葡萄球菌在相當晚的時間點逃逸到細胞質[5]。由此，胞內金葡菌主要寄居在內體、吞噬體和細胞質。應用傳統的抗菌藥物治療金葡菌感染時，抗菌藥物不易進入細胞，難以到達內體和吞噬體，且進入細胞內的抗菌藥物的濃度較低，這就需要頻繁給藥或增加劑量以達到治療效果。但這又會增加治療成本、造成動物不便、副作用、動物可食用組織中的藥物殘留和細菌耐藥性。

研究表明，納米顆粒可顯著增強抗菌藥物在細胞內的積累，增加抗菌藥對耐藥菌株的抗菌活性，還能通過內吞作用和吞噬作用進入細胞，到達內體和吞噬體[6]。通過網格蛋白介導的內吞的納米粒子，由于內體和吞噬體內的低pH和多水解酶的影響，大部分的納米粒子在這里被破壞，包裹的藥物被迅速釋放，瞬時釋放的高濃度藥物能夠有效的殺滅內體和吞噬體內的金葡菌。此外，部分納米粒子能夠從內體和吞噬體逃逸或以囊胞蛋白介導的方式進入細胞質，在細胞質釋放的藥物能夠有效治療細胞質內的金葡菌感染。例如，Xie 等制備的生物相容性好、載藥量高和生產成本低，在獸醫臨床極具應用前景的山崳酸固體脂質納米能使恩諾沙星在RAW.264.7細胞內的濃度提高27.06～37.71倍且藥物停留時間顯著延長，可顯著提高藥物抗胞內金黃色葡萄球菌的活性，為解決奶牛金黃色葡萄球菌乳腺炎的治療難題提供了契機[7]。因此，本文擬介紹固體脂質納米胞內傳遞效率，抗胞內金黃色葡萄球菌的活性及其影響因素，為開發治療金黃色葡萄球菌乳腺炎的固體脂質納米提供新的思路和指導。

1 金葡菌感染的奶牛乳腺炎危害和治療

金黃色葡萄球菌是引起牛乳腺炎的主要病原體，對大多數國家的奶業生產構成極大挑戰[8]。奶牛乳腺炎的高發病率會造成巨大的經濟損失，包括奶業收入的下降，引起生殖并發癥導致獸醫用藥費用的增加以及因更換受污染的牛奶和撲殺受感染動物而產生的費用[9-12]。此外，受金黃色葡萄球菌感染的奶牛所產出的牛奶中含有多種毒素和酶，可導致嚴重的食源性疾病[13]。金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎對全球奶農造成的經濟損失約350億[14]。其中，中國每年的總損失估計超過800萬美元，這還不包括由于牛奶質量下降而導致的乳業企業的經濟損失[15]。全球各國由于金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎的檢出率也很高，例如，在埃塞俄比亞奶牛乳腺炎患病率約為62.6%，其中51.2%的牛奶樣品中分離出金黃色葡萄球菌[16]。在孟加拉國由金黃色葡萄球菌引起的乳腺炎總體流行率約為72.7%，并且亞臨床乳腺炎是所有病例中的主要類型[17]。Wang等調查了中國北京兩個奶牛場的生乳，在195份樣品中，46.2%被檢測出含有金黃色葡萄球菌[18]。

目前，臨床上奶牛乳腺炎的治療以抗生素為主。大多數常規抗菌藥物以外的藥物，包括抗炎藥、生物制劑、中藥等，對奶牛乳腺炎的治療效果與常規抗菌藥物相比，沒有顯著優勢[19]。而在眾多抗生素中，恩諾沙星對于金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎有較好的治療效果。例如，Viveros采用乳房內注射新型二重結晶的恩諾沙星的方式對金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎進行治療，結果發現其治愈率高達95.06%，高于頭孢噻呋67.69%[20]。Schoevers 在體外研究發現恩諾沙星能夠在豬吞噬細胞內積累，并對金黃色葡萄球菌呈現較好的殺滅作用[21]。Kamaruzzaman 用15 mg/L的恩諾沙星殺死了42%～92%的細胞內金黃色葡萄球菌[22]。這是由于氟喹諾酮類藥物是一種廣譜殺菌藥，對金黃色葡萄球菌有較高的抗菌活性，且能以較高的濃度滲透入細胞內，抵抗細胞內細菌感染。但是恩諾沙星在胞內的作用時間較短，且無法在胞內金葡菌寄居部位達到有效殺菌濃度，所以，延長其在胞內金葡菌寄生部位的作用時間十分關鍵，可通過尋找到一種合適的藥物載體以幫助其靶向胞內寄生部位并延長其作用時間，提高治療效果。

2 固體脂質納米治療胞內感染的研究進展

固體脂質納米粒(SLN)是以天然脂質或合成的類脂為載體材料，將藥物包裹或內嵌于類脂核中制成的固體膠粒給藥系統，因其生物相容性、生物可降解性、穩定性、低成本和易于大規模生產而日益受到關注。Uner 等制備了維生素C棕櫚酸固體脂質納米，對其在不同溫度下貯存的穩定性進行了研究，結果發現該納米粒子在4 ℃條件下貯存很穩定，貯存3個月后檢測該納米粒子中有(71.1%±1.4%)沒有發生降解，而將維生素C制成納米乳后，同樣在4 ℃條件下貯存3個月，檢測到其中大部分發生了降解。這說明SLN比納米乳液更穩定[23]。Kalhapure 等增加萬古霉素在固體脂質納米顆粒中的包封率，測得其最小抑菌濃度為31.25 μg/mL,顯著提高了萬古霉素對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的活性[24]。Silva等開發載有維甲酸和月桂酸的固體脂質納米顆粒，并評估了維甲酸-月桂酸負載的脂質納米粒對金黃色葡萄球菌的體外抑制活性[25]。Xie 等制備的恩諾沙星山崳酸固體脂質納米顯著提高了恩諾沙星在小鼠RAW264.7單核巨噬細胞的蓄積能力，有效延長了抗胞內沙門氏菌的抗菌時間[7]。根據以上文獻報道，固體脂質納米可有效提高胞內金葡菌所致奶牛乳腺炎的治療效果。

表1 固體脂質納米增強抗菌藥物治療胞內感染的研究實例

3 固體脂質納米入胞方式及其影響因素

納米顆粒進入細胞主要通過內吞作用。內吞作用主要分為兩種途徑：吞噬作用和胞飲作用。其中，胞飲作用與液相攝取相關，包括巨胞飲作用，網格蛋白介導的內吞作用(CME)，細胞膜穴樣內陷介導的內吞作用(CvME)和網格蛋白和細胞膜穴樣內陷非依賴性內吞作用。

吞噬作用能夠攝取大顆粒[26-27],是吞噬細胞吸收納米顆粒的主要機制。納米粒子的吞噬作用需要與特定的細胞表面受體結合，包括Fcγ受體(FcγRs)，補體受體(CRs)，清道夫受體和Toll樣受體[27]。吞噬作用通過細胞膜動力學以類似拉鏈的方式包裹材料，產生細胞內空泡，稱為吞噬體。吞噬體經歷系列裂變和融合過程即吞噬體成熟，包括與早期吞噬體和晚期吞噬體融合，最終產生吞噬溶酶體[28]。Rab 5，Rab 7，Rab 20，Rab 34和Rab 35等參與吞噬體成熟的調節。Rab35調節吞噬體形成，Rab 34具有粒徑依賴性機制。由于低pH和水解酶的作用，納米顆粒可在吞噬溶酶體中發生降解。

巨胞飲作用是一種大規模的非特異性液體攝取過程，它是來自質膜的肌動蛋白驅動的突起形成杯狀圓形褶邊，當皺褶閉合時，它將細胞外物質轉運到巨噬細胞中的細胞內部。巨胞飲作用形成的內吞囊泡(0.2～5 μm)，稱為巨胞飲體，其成熟受磷酸肌醇和幾種Rab GTP酶的調節。Rab 5和Rab 34參與其形成，Rab 5，Rab 20，Rab 21和Rab 7參與其成熟。研究報道，負載核酸的納米粒子和表面涂層的銀納米粒子被發現使用巨胞飲作用進入肺癌細胞(NCI-H292)和神經干細胞[29]。

網格蛋白介導的內吞作用(CME)是真核細胞彎曲其質膜的小區域以形成將納米顆粒攜帶到細胞內的運輸過程。在哺乳動物細胞的研究發現，在約200 nm的蛋白質幫助下，球形內吞膜內陷形成約100 nm的囊泡。CME是一個多因子參與的復雜過程，超過50種不同的蛋白質在質膜中動態組裝以形成復合物。CME包括以下過程，網格蛋白涂層組裝，膜彎曲，斷裂和囊泡脫落。大多數蛋白質參與該過程的分子機制是清楚的。據報道，自乳化納米脂質體，陽離子聚合物，SLN等均可利用網格蛋白介導的內吞途徑進入胃癌陰性乳腺癌細胞，HeLa細胞和人腦膠質瘤細胞[30-32]。

細胞膜穴樣內陷(Caveola) 是指在特定哺乳動物細胞的質膜中可以找到的具有 50～100 nm 的燒瓶狀內陷[33]。這些結構在平滑肌、內皮細胞和脂肪細胞中含量豐富，覆蓋了質膜面積的大約三分之一。細胞膜穴樣內吞作用(CvME)的發生需要發夾膜蛋白caveolin-1的存在。由于這種蛋白質，細胞膜穴樣內陷呈現出一種特征性的瓶狀結構(60～80 nm)，可以吞噬表面結合的藥物分子和顆粒。除了caveolin-1之外，大多數細胞中還存在其他同類型因子如caveolin-2或caveolin-3。細胞膜穴樣內陷內吞機制的其他參與因子還包括cavin，dynamin，以及囊泡相關膜蛋白(VAMP2)和突觸體相關蛋白(SNAP)(介導隨后的囊泡融合)等[34]。

在細胞攝取后，納米粒子通常被傳遞到早期內體，這是內吞作用的主要分選站。在早期的內體中，一些納米顆粒與受體一起被轉運到再循環的內體中，隨后被排出體外。保留在早期內體中的其他物質沿著微管緩慢移動到細胞內部并與晚期內體融合，最后晚期內體與溶酶體融合[35]。通過不同途徑進入細胞的納米粒子可能在細胞內會經歷不同的轉運途徑。細胞膜穴樣內陷介導的內吞作用的納米粒子，可以繞過內體和溶酶體的優點而受到很多關注[36]。通過吞噬作用的納米粒子將不經過早期內體，因此可能更難以通過回收內體途徑回到細胞外部。此外，通過巨胞飲作用進入細胞的納米粒子可能不經過早期內體，直接被轉運到晚期內體或溶酶體[37]。

4 固體脂質納米治療胞內金黃色葡萄球菌感染的影響因素

納米粒介導的抗菌藥物傳遞是一個復雜多樣的體內動態過程，包括吸收、分布、代謝、排泄和藥物釋放。這一動態過程會影響納米顆粒及其有效載荷藥物的吸收速率。因此，深入研究納米粒子在細胞中的動態過程和其靶向性是研發合適的納米粒子用于有效治療金黃色葡萄球菌感染的前提，關于這一方面的研究有極大的意義。納米粒子在治療胞內感染時受多種因素的影響，其粒徑、表面電荷等被認為是重要的決定因素[38]影響納米顆粒的細胞攝取，細胞內轉運。

4.1 粒徑 粒徑不僅影響細胞吸收納米顆粒的方式，還影響其吸收效率。隨著納米顆粒粒徑的增加，觀察到內化趨勢減小[39]。但是近年來，研究發現粒徑太小或太大都不能很好的進入細胞。例如，Chithrani和Jin都發現金納米粒子在50 nm處的攝取比其他粒徑更多[40-41]。不同大小的粒子攝入細胞的差異可能是由膜包裹納米粒子的效率不同導致的。對于直徑小于最佳粒徑的納米粒子，它們必須聚集在一起才能進入細胞，因此需要很長時間來聚集納米離子。對于較大粒徑的納米顆粒，它們需要延長的包裹期，甚至很少發生內吞作用。對于吞噬細胞而言，最大化攝取納米的粒徑大小也可能具有差異。例如，與具有150 nm的納米顆粒相比，具有500 nm的聚合物納米顆粒顯示出顯著的吞噬效率[42]。

納米顆粒的粒徑也會影響細胞攝取途徑。Saw等發現最小粒徑(30 nm)的納米顆粒被網格蛋白和細胞膜穴樣內陷介導的內吞作用內化，但其他3種粒徑(60，80和100 nm)則僅用網格蛋白介導的內吞作用進行攝取[39]。同樣，Zhu等人研究表明，307.6 nm的二氧化硅納米粒子(SNPs)主要被網格蛋白依賴的內吞作用攝入細胞，而對于167.8和55.6 nm等較小的SNP主要通過網格蛋白和細胞膜穴樣內陷介導的內吞作用[43]。可以發現，較小粒徑的納米粒子利用細胞膜穴樣內陷介導的內吞作用，較大的粒子利用網格蛋白介導的內吞作用[44-45]。

細胞內轉運也受到納米粒子粒徑的影響，例如，Aoyama等發現直徑小于100 nm 的二氧化硅納米粒子在A549細胞中比大于100納米的納米粒子移動分布更快[46]。與沿微管移動的70納米和300納米的納米粒子相比，1000納米的粒子不依賴于快速微管依賴性運輸。此外，內吞途徑也可能影響納米粒子在細胞內的轉運。Aoyama等發現小粒徑的二氧化硅納米粒子主要位于A549細胞的溶酶體中，而較大的粒子大多位于早期內體和晚期內體[46]。Yue等發現13 nm金納米粒子停留在內體中，而50 nm納米粒子則分布在內吞囊泡之外[47]。納米粒子在細胞內的最終目的地跟粒徑大小密切相關[48]。

圖1 影響納米粒子細胞攝取的物理化學因素

4.2 表面電荷 不同表面電荷的納米顆粒表現出不同的內化和細胞內運輸能力，其中，陽離子納米粒子顯示出更有效的細胞內化，因為陽離子納米粒子傾向于粘附到具有負電荷的細胞膜[49-52]。而帶負電荷的納米粒子，所帶的負電荷越低表現出更高的細胞內化能力[53]。近年來，結合兩種相反電荷的納米粒子各自的優點，電荷反轉納米粒子受到越來越多的關注[54]。例如，電荷反轉納米粒子可以在中性或堿性組織中維持負電荷，并且當納米粒子到達酸性腫瘤組織以增強細胞攝取時，表面電荷可以轉變為正電荷[55]。

陽離子納米顆粒不僅高度內化，而且在細胞中累積時間更長。Soenen等發現陽離子磁脂質體不易被細胞排出并保留在細胞內[56]。陽離子納米顆粒可以長時間停留在細胞內是由于它們可以通過內體逃逸到細胞質中。另外，陽離子納米顆粒具有優異的核靶向功能，例如與負電荷和中性電荷納米粒子相比，帶正電荷的超支化聚合物的核積累顯著增強[57]。陽離子納米粒子的核積累也與內體逃逸有關。Yue等觀察到陽離子殼聚糖基納米粒子從內體逃逸并表現出顯著的核積累，而中性和陰離子納米粒子更喜歡保留在內體和溶酶體中[58]。

4.3 表面疏水性 納米顆粒的表面疏水結構易于與細胞質膜快速接觸，導致疏水納米顆粒表現出更高的內化效率。疏水涂層納米粒子顯示出更高效的細胞攝取和較高的肝細胞吸收[59-61]。為了增強體內納米顆粒的穩定性并控制藥物的釋放，已經使用許多親水性聚合物如PEG，PVA和葡聚糖來改性納米顆粒表面的親疏水性。研究發現涂有聚(環氧乙烷)(PEO)的納米顆粒顯著延遲了巨噬細胞的攝取效率和時間[62]。Du等發現納米粒子在體內的循環時間隨著表面PEG密度的增加而延長[63]。小分子表面修飾的納米顆粒通過減少了其與吞噬細胞的清除劑受體的相互作用而呈現出較低的攝取效率[64]。親水/疏水比為1.7～2.0的聚合物膠束表現出最佳的細胞攝取效率[65]。

疏水性不僅影響納米顆粒的內吞效率，而且還影響細胞內的命運。疏水增強的乙二醇殼聚糖納米粒子在整個細胞中的分布增強。另外，疏水性納米顆粒在細胞器中積累也呈現增強。陷入溶酶體的疏水修飾的淀粉納米粒子傾向于遷移到細胞核，PEG修飾增強了碳納米管在線粒體中蓄積的可能性[66-67]。Yu等比較了MDCK細胞中不同疏水改性膠束的內吞作用和胞吐作用[68]，結果表明，PEG-DSPE膠束由于其較高的疏水性而具有更快的內吞作用和胞吐作用。

5 展 望

固體脂質納米由于其獨特的生物學性能而被用作抵抗金黃色葡萄球菌胞內感染的有效載體，而且比傳統制劑更具優勢。但是，針對金黃色葡萄球菌感染的納米系統的研究還不完善，面臨的主要挑戰有固體脂質納米在胞內的動態過程和靶向性，各種理化因素對其胞內轉運過程皆會產生影響。由于納米粒子在細胞內轉運的復雜性和不可預測性，影響藥物吸收速率，關于固體脂質納米粒子的臨床療效仍值得懷疑，應加強其臨床評價。可針對胞內金黃色葡萄球菌研究納米顆粒在細胞水平上的轉運機制來開發智能納米粒子，以提高金黃色葡萄球菌胞內感染疾病的治療效果。