馬波沙星注射液無菌檢查方法的建立

趙富華，于曉輝，楊 星，龔旭昊，馬秋冉，董玲玲

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

馬波沙星作為第三代喹諾酮類抗菌藥物，具有抗菌譜廣，消除半衰期長，生物利用度高的特點，在獸藥市場具有良好的發展前景，國內企業自2014年起陸續申報馬波沙星及其制劑，擬在《中國獸藥典》2020年版中制定馬波沙星及制劑的質量標準。為控制產品質量，需對馬波沙星注射液進行無菌檢查方法的研究[1-2]。馬波沙星具有抑菌作用，所以擬采用薄膜過濾法對馬波沙星注射液的無菌檢查進行方法學研究[3-5]。

1 材料與儀器

1.1 樣品 馬波沙星注射液(河北遠征藥業有限公司生產，規格：100 mL:10 g，批號為16B180301、16B180302、16B180303)。

1.2 稀釋劑及培養基 0.1%無菌蛋白胨水溶液、硫乙醇酸鹽流體培養基(批號20180710)、胰酪大豆胨液體培養基(批號20180710)、胰酪大豆胨瓊脂培養基(批號20180710)、沙氏葡萄糖液體培養基(批號20180710)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(批號20180710)，均由北京中海生物科技有限公司提供。

1.3 菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]，均購自中國藥品生物制品檢定研究院。

1.4 試驗儀器 HTY-1650AG3型無菌隔離器(浙江泰林生物技術股份有限公司)、無菌試驗集菌培養器(浙江泰林生物技術股份有限公司，型號：EVS3，批號：20170812)、生物安全柜(美國Nuaire公司)、SPX-250B-Z型生化培養箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)、GI7-2型恒溫培養箱(美國Shellab公司)。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備 分別取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養物1白金耳，接種于10 mL胰酪大豆胨液體培養基中，經30～35 ℃培養18～24 h，取1 mL分別加入9 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，作為10-1管，逐管10倍稀釋至小于100 cfu/mL，活菌計數備用。

取生孢梭菌的新鮮培養物1白金耳，接種于10 mL硫乙醇酸鹽流體培養基中，經30～35 ℃培養18～24 h，取1 mL加入9 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，作為10-1管，逐管10倍稀釋至小于100 cfu/mL，活菌計數備用。

取白色念珠菌的新鮮培養物1白金耳，接種于10 mL沙氏葡萄糖液體培養基中，經20～25 ℃培養24～48 h，取1 mL加入9 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，作為10-1管，逐管10倍稀釋至小于100 cfu/mL，活菌計數備用。

接種黑曲霉的新鮮培養物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基上，20～25 ℃培養5～7 d，加入3～5 mL含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無菌試管內，取1 mL加入9 mL 含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，作為10-1管，逐管10倍稀釋至小于100 cfu/mL，活菌計數備用。

2. 2 活菌計數 分別取上述細菌菌液1 mL加入培養皿，每種菌液做2個平皿，注入胰酪大豆胨瓊脂培養基約18 mL，置30～35 ℃培養24～48 h。取生孢梭菌菌液1 mL，置于200 mL硫乙醇酸鹽流體培養基中，置30～35 ℃培養24～48 h。分別取上述真菌菌液1 mL加入培養皿，每種菌液做2個平皿，注入沙氏葡萄糖瓊脂培養基約18 mL，置20～25 ℃培養48～72 h。計數結果見表1。

表1 活菌計數結果

2. 3 培養基的靈敏度檢查 取每管裝量為12 mL的硫乙醇酸鹽流體培養基7支，分別接種小于100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養3 d。另取每管裝量為9 mL的胰酪大豆胨液體培養基7支，分別接種小于100 cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養5 d。以空白對照管應無菌生長，加菌的培養基管生長良好來判定該培養基的靈敏度檢查符合規定。試驗結果見表2。

表2 培養基靈敏度檢查結果

經檢查，空白對照管均無菌生長，加菌培養基生長良好，該培養基的靈敏度檢查符合規定。

2.4 無菌檢查方法適用性試驗(薄膜過濾法)

2.4.1 供試品陽性菌試驗組 取供試品10支，每支取20 mL，用封閉式薄膜過濾器過濾后，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜，每膜每次100 mL，沖洗6次，在最后一次沖洗液中分別加入小于100 cfu/mL的菌液1 mL，過濾后，每個濾筒內灌注培養基，其中金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌在硫乙醇酸鹽流體培養基中，30～35 ℃條件下培養5 d，枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉在胰酪大豆胨液體培養基中，20～25 ℃條件下培養5 d，各2組。

2.4.2 陽性菌對照組 取封閉式濾筒，其中三濾筒加入硫乙醇酸鹽流體培養基，分別接種小于100 cfu/mL的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各1 mL，30～35 ℃條件下培養5 d；另三筒加入胰酪大豆胨液體培養基，分別接種小于100 cfu/mL的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉1 mL，20～25 ℃條件下培養5 d。

2.4.3 供試品陰性組 取供試品10支，每支取20 mL，用封閉式薄膜過濾器過濾后，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜，每膜每次100 mL，沖洗6次，再分別加入硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基，置規定溫度下培養5 d。

2.4.4 陰性對照組 取封閉式濾筒2個，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗，沖洗次數與沖洗量與試驗組相同，向濾筒中分別加入硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基，置規定溫度下培養5 d。

2.4.5 方法適用性試驗結果 結果表明(表3、表4)，本品采用薄膜過濾后，含供試品的陽性菌試驗組沖洗6次時試驗菌均生長良好，表明沖洗6次后，供試品對細菌生長沒有影響。

表3 供試品陽性菌試驗組與陽性菌對照組試驗結果

表4 供試品陰性組與陰性對照組試驗結果

2.4.6 供試品無菌檢查 取三批供試品，按照驗證過的無菌檢驗方法進行檢查。結果顯示，陽性對照菌在24 h內生長良好，陰性對照14 d內均澄清，無菌生長，供試品14 d內均澄清，無菌生長，無菌檢查結果符合規定。

3 討論與結論

本試驗依據《中國獸藥典》2015年版一部附錄1101無菌檢查法方法適用性試驗的要求[6](亦符合《中國獸藥典》2020年版一部附錄1101的要求)，對馬波沙星注射液無菌檢查方法進行驗證，因馬波沙星具有抑菌作用，故采用薄膜過濾法，考察沖洗次數，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜，每膜每次100 mL，沖洗3、4、5次，結果沖洗3、4、5次時，除白色念珠菌和黑曲霉供試品陽性生長外，其他供試品陽性菌均無菌生長，說明沖洗5次時供試品還有抑菌作用，根據預實驗結果，確定沖洗6次，結果與陽性菌對照組相比，供試品陽性菌試驗組生長情況均良好，說明該條件下能夠有效清除藥物自身的抑菌活性且不影響試驗菌的生長，而供試品陰性對照組與陰性對照組中均無細菌生長，說明前處理及操作過程中不會引入其他細菌的污染。最終確立檢查方法為：取本品，經薄膜過濾法處理，依法檢查(附錄1101)，應符合規定。具體操作步驟：供試品取10支，每支取20 mL，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗濾膜，每膜每次100 mL，沖洗6次，該方法科學、可靠，在該無菌檢查條件下可去除藥物的抑菌干擾。

薄膜過濾法可用于馬波沙星注射液的無菌檢查。在做馬波沙星注射液無菌檢查時，一定要注意沖洗次數，否則易致試驗失敗(供試品陽性菌不生長)。