microRNA與功能性腸病

鄢香蕓 姚俊鵬 張微 楊雨晴 牟林軒 陳敏 李瑛

1成都中醫藥大學針灸推拿學院/第三附屬醫院（成都610075）；2成都中醫藥大學教務處（成都611137）；3成都中醫藥大學臨床醫學院/附屬醫院（成都610075）；4成都中醫藥大學研究生院（成都610075）

功能性腸病（functional bowel disease，FBD）是由腸道功能紊亂導致的以腹痛、腹脹、和排便習慣改變等為主要癥狀的一系列腸道疾病，臨床以腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）和功能性便秘（functional constipation，FC）最常見［1］。FBD 由多種因素誘發，腸屏障/運動功能、內臟高敏感性、炎癥反應、腸道菌群失調及腦?腸互動異常等因素可能參與FBD 的發病機制。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長約22 個核苷酸，進化上高度保守的內源性、非編碼單鏈RNA，與多種疾病的發生發展密切相關。miRNA 在基因網絡調節中發揮核心作用，其代表了一種新的作用模式，具有精確傳遞信號和放大信號的能力［2］。越來越多的證據表明，miRNA 通過對FBD 靶基因的調控及相關信號通路的活化在腸黏膜屏障、腸道動力、內臟超敏、炎癥反應等方面發揮重要作用。深入研究miRNA與FBD 的關系對闡釋該類疾病的潛在生物標志物、治療靶標及發病機制等方面具有重要意義。目前miRNA 在功能性腸病中的作用已是研究熱點，因此本文將miRNA 在FBD 中作用的研究進展綜述如下。

1 microRNA 概述

miRNA 指在內源性非編碼RNA 中一類長度約為22 個核苷酸的單鏈小分子RNA，其靶基因種類繁多且數目巨大，廣泛地參與到許多細胞信號轉導系統中。miRNA 經由三個階段加工成熟：首先在細胞核中，miRNA 被RNA 聚合酶Ⅱ轉錄為含有5′帽和3′聚（A）尾的pri?microRNA；之后由RNaseⅢ酶Drosha 和雙鏈RNA 結合蛋白DGCR8 組成的復合體切割得到長度約為70 個核苷酸的前體miRNA；最后前體miRNA 被轉運蛋白運出到細胞質，由另一種RNase Ⅲ型酶Dicer 和AGO 蛋白加工處理為長度約22 個核苷酸的成熟miRNA。miRNA可通過交叉調節、自我調節、可逆性調節等方式在轉錄后水平與靶mRNA 特異性的堿基互補配對，引起靶mRNA 降解或抑制其翻譯，實現靶基因表達的負調控［3］。miRNA 不僅是遺傳信息的內源性調控者，也是細胞間遠距離通訊的媒介。研究證實，miRNAs 在體液中經細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）或胞外小體穩定遷移，被靶細胞內吞后介導信號的遠距離傳導［4］。每個miRNA 可同時調節多個靶基因，不同的miRNA 也可以協同調控同一靶基因，由此形成復雜的調控網絡，精細調控基因的表達，廣泛參與細胞的增殖、分化和凋亡等多個環節，與多種疾病的發生發展密切相關［5］。

2 microRNA 在FBD 不同組織中的表達

MART?NEZ 等［6-7］分析了FBD 和健康受試者腸組織中miRNA 的表達，發現miR?16 和miR?103 在IBS?D 患者空腸黏膜中的表達顯著下調。而在慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）患者結腸組織中，存在13 個表達上調的miRNA。進一步研究發現，體內誘導的STC 大鼠模型和體外培養的結腸平滑肌細胞中，過表達的Let?7f 可能通過下調SCN5A 基因的表達，降低鈉離子通道NaV1.5 的電流密度和腸道平滑肌收縮性，進而減緩結腸傳輸功能。提示Let?7f 可能作為腸道傳輸功能的分子調節器，在STC 或其他腸道動力性疾病的病理生理中扮演重要的角色。

miRNA 不僅定位于結腸細胞內，還會被轉運到細胞外，可以在血液、尿液等體液中檢測其含量。GUO 等［8］發現IBS?D 患者血清中miR?1305、miR?575、miR?149、miR?190、miR?135a、miR?210、miR?148a 和miR?151?3p 表達顯著上調；而miR?22、miR?483?3p、miR?194、miR?887、miR?1、miR?127?5p 和miR?892b 表達明顯下調。監測外周血中miRNA 的表達水平可能為FBD 的臨床診斷提供了一種非侵入性的生物學指標。血液微泡是EVs 的一種，能通過彌散、內吞等方式進入靶細胞，轉運特異性蛋白、miRNA 等生物活性物質，促進細胞間信息交流。IBS?D 患者血液微泡中miR?29a 表達增加，推測其可作為腸膜通透性增強的IBS?D 患者的獨特分子標記物［9］。此外，IBS 不同亞型患者外周血中miRNA 表達也存在差異。不確定型和混合型IBS 患者血清中miRNA?144、miRNA?29a 和miRNA?200a 表達水平顯著高于其他亞型。而單純便秘型和腹瀉型IBS 僅miRNA?29a 和miRNA?200a 表達水平存在差異［10］。由此可見，miRNA 在外周血的差異表達為臨床IBS 分型及診斷提供參考。

在FBD 動物模型的研究中，有學者運用液相芯片技術結合RT?PCR 驗證的方法，發現在內臟超敏大鼠結腸黏膜中，let?7f、let?7i、miR?130b、miR?29a、miR?132、miR?21 和miR?375 的表達上調，而miR?24、miR?31a、miR?192、miR?221 和miR?223 的表達下調［11］。在嗎啡加大黃誘導的STC 雌鼠結腸組織中，miR?128 的表達顯著下調，與該團隊前期的臨床研究結果一致，這顯示出miR?128 作為STC診斷生物標志物的運用前景［12］。

miRNA 在外周血和腸組織中存在差異性表達（表1），表明miRNA 可能參與調節FBD 的發生發展，這為FBD 的生物學診斷提供了新靶標。

表1 部分miRNA 在功能性腸病中的表達Tab.1 The expression of miRNAs in functional bowel diseases

3 miRNA與FBD 發病機制

3.1 miRNA與腸黏膜屏障腸黏膜屏障分為機械屏障、免疫屏障、生物屏障與化學屏障，各個屏障結構和功能上的完整由緊密連接蛋白、促炎癥細胞因子和腸道菌群等共同維持［13］，能有效阻擋致病微生物和有毒化合物進入循環，維持機體內外環境的穩態。屏障受損可導致腸道功能紊亂，甚至敗血癥和多器官功能障礙等全身性病變［14］。越來越多的證據表明，miRNA 在基因網絡調控中發揮重要作用，能從多種途徑調控相應的靶基因調節腸屏障功能。

3.1.1 緊密連接緊密連接是機械屏障中最為重要的一環，主要包括咬合蛋白（Occludin）、閉合蛋白（Claudins）、連接黏附分子（JAM）和閉合小環蛋白（ZOs）。這四種跨膜蛋白和分子將相鄰的腸上皮細胞連接在一起，維持細胞極性和黏膜屏障功能［15］。

在IBS?D 患者空腸活檢組織中，miR?125b 和miR?16 表達降低，靶向上調緊密連接蛋白的表達，促進腸上皮屏障功能恢復［16］。體內研究發現，IBS?D 模型小鼠結腸miRNA?29a 表達升高，靶基因ZO1和CLDN1 表達降低，結腸黏膜損傷進行性加重；敲除miR?29 基因后，可顯著上調CLDN1 和NKRF的表達來逆轉腸黏膜的高通透性［9，17］。由此表明miR?29a 可通過靶向抑制緊密連接蛋白加重腸黏膜屏障損傷。另一項體外研究發現miR?144 對緊密連接蛋白也具有類似的調控作用［18］。

3.1.2 免疫與炎癥反應低等級的粘膜炎癥和免疫激活與FBD 免疫屏障功能損傷和神經元異常敏感性有關。巨噬細胞和肥大細胞作為一類重要的固有免疫細胞群，廣泛分布于皮膚、消化道和氣道等部位，以及時應對環境中的變應原做出免疫應答。當機體受到外界刺激，如微環境改變，生理和心理應激等均可使腸道內大量的炎癥細胞迅速活化，釋放多種生物活性介質和細胞因子，引發內皮和上皮的通透性增加［19-20］。而miRNA 作為一種重要的細胞間通訊分子，亦參與調節胃腸道炎癥反應。有研究表明［21］，FC 患者結腸組織中異常增加的巨噬細胞和肥大細胞與miR?128 表達下調相關，且過表達的miR?128 可下調FC 患者結腸組織中肥大細胞數量，抑制胃腸道炎癥反應。此外，miR?181c?5p 可以負調控炎性因子IL1A 的表達，減輕由冰醋酸灌腸聯合直腸球囊刺激誘導的IBS 大鼠的腸道炎癥反應［22］。類胰蛋白酶/PAR2 是經典的炎癥信號通路。研究發現，miRNA?490?5p可激活肥大細胞類胰蛋白酶/PAR2 信號通路，誘發IBS?D 腸道黏膜的持續低度炎癥反應［23］。

3.1.3 腸道菌群腸道菌群是腸道生物屏障中的重要部分，參與腸黏膜上皮細胞的增殖、分化。腸道微生物群的失衡可能促進病原體與腸壁粘附，損害腸屏障功能［24］。

miRNA 可作為宿主細胞與腸道細菌交流的橋梁，由宿主細胞發送后進入細菌內，調節細菌基因的表達和生長，維持腸道穩態［25］。研究發現腸上皮細胞和Hopx 基因陽性細胞（如杯狀細胞）的miRNA 可進入腸道細菌體內，靶向調節細菌相關基因轉錄，造成腸道菌群相關代謝途徑的改變，影響細菌生長；而miRNA 缺陷型小鼠更容易出現腸道菌群紊亂，在給予糞便miRNA 移植后可重塑其腸道菌群并減輕胃腸道癥狀［26］。MANSOUR 等［27］首次研究了大腸菌群和血清miRNA?199b 水平的具體關系，發現與健康對照組相比，IBS 及不同亞型患者糞便培養中大腸菌群數量顯著增加，血清中miRNA?199b 表達明顯下降，兩者呈負相關，表明miRNA 可能對腸道菌群起負調控的作用。

此外，腸道菌群也能調節miRNA 在FBD 中的表達。腸道共有細菌過分泌的肽聚糖可通過Toll樣受體2/4 信號途徑誘導腸上皮細胞miR?21?5p的轉錄，抑制厭氧菌、梭狀芽孢桿菌Ⅳ等有益菌的翻譯，導致SCFAs、二氧化碳、甲烷等含量減少［28］。有研究發現，乳酸桿菌L.caseiLC01 通過抑制腸上皮細胞中miR?144 的表達水平，上調緊密連接蛋白的表達，促進IBS 患者腸上皮屏障功能恢復［18］。當前，益生菌制劑治療FBD 的有效性已被證實［29］，但miRNA與腸道菌群的相關性在FBD 中的研究相對較少，值得深入探討兩者的關系和調控機制，為FBD 的臨床診斷和治療提供新靶點。

3.2 MicroRNA與內臟高敏內臟高敏指內臟組織對刺激過度反應，與神經信號的傳導密切相關。有研究者通過慢病毒基因沉默技術使miRNA?490?5p 表達下調，降低內臟高敏模型大鼠的結腸敏感程度［30］。

miR?199a 能抑制瞬態受體勢葉片蛋白1 型（TRPV1）離子通道的活性，減弱感覺神經元的信號傳導；腹腔注射lenti?miR?199a 前體可上調miR?199a 的表達，減少TRPV1 信號來降低內臟超敏反應［31］。提示miR?199a 的降低可能是IBS 患者內臟高敏的關鍵因素。而miR?199 前體可能是內臟疼痛患者的候選治療方法。大麻素受體1（CNR1）是內臟超敏的重要調節劑，與FBD 中的癥狀表型、疼痛知覺、神經傳播抑制和結腸轉運有關［32］，抑制CNR1 的表達可增強內臟敏感性。體內實驗表明，miR?200a 可通過下調CNR1 和血清素轉運體SERT的表達來誘導內臟超敏，加重或導致IBS?D 的發病［33］。

在WAS 誘導的IBS 小鼠的結腸上皮細胞中，神經遞質5?HT 受體HTR7 是miRNA?29a 的靶基因；敲除IBS 小鼠miRNA?29a 能增加HTR7 水平，減輕胃腸道癥狀和腹痛嚴重程度。體外實驗證實，miRNA?29a 抑制劑增強了HTR7 的表達，而模擬miRNA?29a 可下調腸道上皮細胞中HTR7 的表達［34］。表明miRNA?29a 可以負性地調節HTR7 的表達，miRNA?29a 抑制劑在腸道高敏的預防和治療中有應用價值。

3.3 miRNA與腸動力腸道動力失調是FBD發病的重要機制。研究表明，miR?let?7f、miR?let?7e、miR?200a?3p 和miR?429 可通過抑制靶基因SCN5A的表達，降低結腸平滑肌細胞NaV1.5 通道的電流密度，進而增加平滑肌條收縮頻率及振幅，改善腸道動力［7］。平滑肌細胞特異性敲除miRNAs 基因的小鼠，平滑肌表型、功能及基因表達譜急劇變化這一現象也佐證上述觀點［35］。

腸道間質細胞（interstitial cell of cajal，ICC）分布于胃腸道內各肌層，是腸神經元與平滑肌細胞（smooth muscle cell，SMC）的中間媒介。ICC 還是胃腸慢波活動的起搏細胞，除極化后觸發慢波，通過縫隙連接傳遞至SMC，引起平滑肌收縮。有團隊［36-38］運用基因芯片技術檢測STC 患者病變結腸組織中miRNA 的表達，發現miR?128 和miR?129 表達明顯下調。為進一步探索miRNA 調控腸動力的信號通路，該團隊從重度STC 患者病變結腸組織中取樣，發現miR?128 可通過調節SCF 和IGF 信號通路改變結腸ICC 的形態；而miR?129 可能通過調控N 乙酰氨基半乳糖基轉移酶1/轉化生長因子?β1信號通路，誘導ICC 細胞轉分化，影響腸道蠕動。在STC 大鼠模型結腸組織中，miR?222 過表達使c?kit 和干細胞因子表達水平下降，誘導ICC 細胞凋亡和自噬過度［39］。這些研究充分證實，miR?128、miR?129 和miR?222 可通過調節胃腸動力相關細胞的形態和功能參與FBD 的發病機制，是FBD 的重要研究靶點。

4 討論

功能性腸病是一類以慢性或反復發作的腸道癥狀為診斷標準的非器質性疾病，以IBS 和FC最常見。流行病學調查研究顯示，FBD 患病率為28.6%～ 31.7%［40］，其高發病率和病程的持久性嚴重影響了患者的生活質量和身心健康。臨床上FBD 的診斷缺乏“金標準”，往往是結合臨床表現、腸鏡檢查等，排除其它器質性腸道疾病后確診；而治療多是以改善癥狀為主的多學科綜合模式。研究發現［41］，約有46%的FBD 患者常陷入反復就醫的痛苦當中，加重了社會經濟和醫療的負擔。因此，當前亟待建立基于分子水平的FBD 精準化的診斷和治療體系。

4.1 miRNA與FBD 診斷FBD 的診斷和鑒別診斷目前仍依賴于臨床癥狀，羅馬IV 認為FBD 以病理生理特征的聯系存在于一個癥狀譜中，其中FC患者也可能伴隨腹痛或腹脹［42］，這極大增加了IBS和FC 鑒別診斷的難度。miRNA 在FBD 患者不同組織和疾病分型的表達中存在差異，而血液和體液中的miRNA 穩定性較高，有望成為疾病診斷、鑒別診斷和精準分型的非侵入性標志物。同時，對FBD 病情的評估也需要有效的生物標志物。FBD患者的癥狀往往不能代表腸道功能障礙的嚴重程度，若以患者的癥狀指導臨床用藥往往會導致對FBD 患者的不當治療。研究顯示約有25%的FBD 患者沒有明顯的腸道癥狀卻接受了過度的臨床治療［43］。GUO 等［8］研究發現miRNA 的表達可能與病情嚴重程度相關，IBS 患者外周血miR?148a?3p 的水平隨腹痛程度的減輕而顯著下降，這為臨床上把控FBD 的病情進展和預后指明了方向。

4.2 miRNA與FBD 治療調控miRNAs 的水平可一定程度上緩解腸功能紊亂，因此miRNAs 可作為FBD 的潛在治療靶標。根據其在疾病發生發展中發揮的作用不同（表2），主要采取抑制致病性miRNA 或模擬關鍵miRNA 等治療策略。許多miRNA 的潛在治療作用已通過反義寡核苷酸［9］、過表達［22］、siRNA［35］、CRISPR/cas9［34］、shRNA［44］等多種技術手段在FBD 動物模型上得到驗證。在IBS 小鼠模型中，利用反義寡核苷酸技術抑制miR?24 的表達能增加近端結腸的疼痛閾值，有效減輕胃腸道癥狀和腹痛嚴重程度［45］。研究發現［17，34］，miR?29a 抑制劑能精準調控ZO1、CLDN1 和HTR7等靶基因的表達，同時逆轉內臟高敏，腸屏障損傷等多個病理過程，為FBD 的靶向治療提供參考。此外，FBD 患者個體差異明顯，深入挖掘不同患者的核心miRNA 有助于實現FBD 的個體化治療。

表2 不同miRNA 在功能性腸病中的作用機制Tab.2 The mechanism of miRNAs in functional bowel diseases

但是近年來以RNA 為基礎的治療方法在FBD中發展較緩慢，功能性腹瀉、餐后不適綜合征等疾病的相關研究尚待開展。篩選每種疾病類型或不同人群的核心miRNA 仍是極大的挑戰。在臨床應用中，也可能面臨潛在毒性和脫靶等問題。因此今后應繼續開展大量研究，深入探討miRNA 在FBD 中的調控機制，實現精準化診療理念向臨床應用的轉化。