果糖二磷酸鈉注射劑質量評價與研究

劉冰瀅，穆矛，鄧鋒，梁蔚陽，薛巧如

廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510663

20 世紀初，有研究者在研究糖代謝機理時完成了1,6-二磷酸果糖（fructose-1,6-diphosphate,FDP）的分離和鑒定［1］。1942 年，美國Neuberg 等利用新鮮酵母細胞使葡萄糖磷酸化制備了果糖二磷酸鈉［2］。國內上海新亞藥業有限公司首家仿制并獲得批準文號，之后陸續有多家企業研究開發了此品種，臨床應用進一步穩固并擴大。多項研究表明，果糖二磷酸鈉對人體代謝調節具有多種功能，靜脈注射果糖二磷酸鈉鹽可用于心肌缺血疾病的輔助治療［3-6］。果糖二磷酸鈉劑型有無菌分裝粉針、大輸液、口服液、片劑，膠囊等。

果糖二磷酸鈉系列產品為非基本藥物品種，是醫保目錄的乙類目錄品種。截至2016 年11 月，國內共40 家企業生產果糖二磷酸鈉注射制劑，批準文號80 個；其中，注射液17 家，批準文號26 個，2 個規格；注射用粉針23 家，批準文號54 個，4個規格。本次抽取的果糖二磷酸鈉注射液樣品共計55 批，涉及5 家生產企業，8 個批準文號，2 種規格（50 mL∶5 g；100 mL∶10 g）；注射用果糖二磷酸鈉63 批，涉及10 家生產企業，22 個批準文號，4 種規格（2.5 g；5 g；7.5 g；10 g）。抽樣分布于全國21 個省份，其中生產單位抽樣21 批，醫療機構抽取 41 批，在經營單位抽取56 批，樣品確認率為100%，均為標示企業產品。

1 儀器與關鍵試劑

儀器：UV-2550 紫外可見分光光度計（日本島津儀器有限公司）；E2695 型高效液相色譜儀，包括紫外檢測器、Empower 3 數據處理軟件等（Waters 公司）；SOLAAR M6 型原子吸收分光光度計（Thermo，GF95 型石墨爐，FS95 自動進樣裝置）；石墨管（Thermo Coated Graphite）；KY-Ⅱ型AL 空心陰極燈（北京曙光明電子光源儀器有限公司，燈號：3931）；離子色譜儀（Thermo Dionex ICS-5000）；電子天平（Sartorius CPA225D）；pH 計（Sartorius PB-10）；水分測定儀（Metrohm 756）。

關鍵藥品和試劑：固體復合酶（北京眾宜隆潤科技有限公司，批號LRY2016110102）；磷酸二氫鉀對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100745-201503，含量100%）。

2 質量標準

照國家藥品標準WS1-（X-063）-2001Z-2011和WS1-（X-064）-2001Z-2011 分別測定果糖二磷酸鈉注射液和注射用果糖二磷酸鈉。

3 結果與分析

3.1 現行質量標準檢驗

果糖二磷酸鈉注射液按現行質量標準檢驗共發現10 批不合格，占注射液抽樣總數的18.2%，涉及的生產企業2 家，不合格項目均為游離磷酸鹽。注射用果糖二磷酸鈉有1 批不合格，占注射用粉針抽樣總數的1.6%，涉及生產企業1 家，不合格項目為熱原。

3.1.1 游離磷酸鹽55 批次果糖二磷酸鈉注射液共有10 批次游離磷酸鹽測定結果不符合規定，涉及2家生產企業；注射用粉針該項目均符合規定，具體結果見圖1。目前法定標準采用比色法檢測游離磷酸鹽，在酸性介質中，正磷酸鹽與鉬酸銨反應，生成磷鉬雜多酸，經亞硫酸鈉等還原劑將其還原生成藍色絡合物。此方法簡單、方便，重復性較好。檢驗過程中發現不合格的產品均來自醫療單位和流通領域。不合格批次中標示批號為1505242101 和1506120562 兩批流通領域抽樣產品，在生產企業也抽檢到該2 批次樣品，其游離磷酸鹽檢查卻符合規定。不合格批次的樣品集中在2 家生產企業，其余企業的所有樣品均符合規定。經調研了解到不合格企業采用熱處理輔助滅菌加除菌過濾的生產工藝，而其他3 家生產企業則均采用無菌生產工藝，提示熱處理可能是游離磷酸鹽含量超限的原因之一。

圖1 游離磷酸鹽測定結果

3.1.2 熱原63 批次注射用果糖二磷酸鈉中有1 批次熱原不符合規定，不合格率為1.58%。這可能與原料和制劑生產過程中微生物污染有關，提示企業應嚴格控制生產環境。

3.1.3 其他項（1）果糖二磷酸鈉注射液其他項目包括性狀、鑒別、pH 值、顏色、異常毒性與熱原、無菌、含量測定等，均符合規定。五家企業產品的pH 值分布較為分散，有2 家企業的產品pH 值分布在3.08～3.84，另外3 家企業產品的pH 值分布在4.21～4.59，可能是輔料和生產工藝導致這種差異。采用酶法測得果糖二磷酸鈉的含量，限度為90.0%～110.0%，均符合規定。大部分產品含量分布在93.1%～102.7%，顯示基本控制在一個合理的水平范圍。（2）注射用果糖二磷酸鈉其他項目主要包括性狀、酸度、溶液的澄清度與顏色、水分、異常毒性、無菌、含量測定等，均符合規定。所有樣品的pH 值均在5.5～6.5，大部分產品pH 值主要分布在6.01～6.09，分布集中，標準設置合理。按無水物計算樣品含量，大多數樣品結果在99%～100%的范圍，各廠家差異較小，質量穩定。

3.2 探索性研究結果與分析

根據產品的特點及其標準檢驗中存在的問題開展了9 項探索性研究，包括薄層色譜鑒別、溶液吸光度、有關物質分析、滲透壓、5-羥甲基糠醛、鋁含量、輔料分析、加速穩定性考察及模擬滅菌試驗。

3.2.1 薄層色譜鑒別現行標準鑒別項下薄層色譜主斑點拖尾嚴重，影響展開效果。參照果糖二磷酸鈉原料薄層色譜鑒別方法，同時針對主斑點過大，拖尾較為嚴重的情況，將點樣量由5 μL 減少為1 μL，效果良好。

3.2.2 溶液吸光度吸光度作為注射劑的一項重要理化指標，主要考察產品外在性狀是否發生了改變，從而可以了解產品質量的波動。果糖二磷酸易降解，生成醛類物質，可聚合形成聚合物，從而導致溶液顏色發生改變，因此有必要對其吸光度進行檢查以控制產品的質量。在380 nm 的波長處測定吸光度，其中注射液全部小于0.15，注射用粉針全部小于0.10，說明該項目風險較小。

3.2.3 有關物質分析針對注射用粉針劑現行標準采用微晶纖維素板進行薄層色譜檢查，除果糖有顯色斑點外，其他3 種成分1,6-二磷酸果糖、6-磷酸果糖、6-磷酸葡萄糖均無明顯顯色斑點的問題進行方法研究和探索，調整方法，采用硅膠G 板，以正丁醇-冰醋酸-水-丙酮-10%氨溶液為展開劑，顯色劑改為苯胺-二苯胺丙酮溶液。經試驗，發現該方法顯色效果比原標準好，4 種成分都能顯色。混合對照品溶液中，果糖和 6-磷酸葡萄糖能顯示2個清晰分離的斑點，但6-磷酸果糖和果糖二磷酸鈉2 個點不能明顯分離。但由于該方法本身靈敏度和分離度局限，不能很好地考察產品的有關物質。

果糖二磷酸鈉系列品種中，根據其合成工藝，葡萄糖、果糖、6-磷酸葡萄糖為工藝雜質，6-磷酸果糖為降解雜質。針對果糖和葡萄糖，采用HPLC 法示差檢測器進行分析，所有抽取樣品均未檢出。采用酶法對6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖2種雜質進行測定，注射液2 種雜質之和均低于2.0%，注射用粉針均低于0.5%，提示該項目風險較小。

3.2.4 滲透壓溶液的滲透壓依賴于溶液中溶質粒子的數量，制劑過程中添加的各種輔料會導致滲透壓的增高，是重要的安全性指標。有1 家企業所有注射液產品滲透壓均大于1 000 mOsm/kg，其余企業產品的結果均小于700 mOsmol/kg；63 批次注射用粉針產品中有8 批大于700 mOsmol/kg。

3.2.5 5-羥甲基糠醛5-羥甲基糠醛是1 種呋喃類化合物，有研究表明，5-羥甲基糠醛對眼睛、上呼吸道、皮膚和黏膜等有刺激性；對人體橫紋肌及內臟有損害，且具有神經毒性，能與人體蛋白質結合產生蓄積中毒［7］。采用HPLC 法測定5-羥甲基糠醛，注射用粉針均未檢出，注射液中5-羥甲基糠醛含量不同廠家產品之間差異較大。有1 家生產企業的2 批產品5-羥甲基糠醛含量超過2 μg/g，其中1 批達到4.8 μg/g，其余生產企業的產品5-羥甲基糠醛含量均低于1 μg/g［8］。

3.2.6 鋁含量從2004 年7 月起，FDA 要求生產廠家對大多數腸外營養液中的鋁進行定量。大容積的注射用溶液,如葡萄糖、氨基酸、脂肪乳和注射用蒸餾水，要求其鋁含量低于25 μg/L。采用原子吸收分光光度法對所有抽取樣品進行測定，本次抽取注射液中鋁含量覆蓋范圍從4～500 ng/mL，55 批次樣品中有18 批次鋁含量超過200 ng/mL，存在風險。不同企業控制情況不同，其中有1 家企業所有批次樣品均控制在20 ng/mL 以下，遠低于其他4 家企業。注射用粉針63 批次樣品有2 批次大于2 μg/g，為同一公司產品，最高達到3.5 μg/g，其余企業產品大部分小于1 μg/g。進一步研究發現原料供應商產品鋁含量與注射液終產品有直接關聯［9］。

3.2.7 輔料分析研究采用離子色譜法分別對樣品中Cl-和SO42-進行測定。分析結果發現，有1 家企業產品Cl-含量遠高于其他企業，該企業產品滲透壓也均超過1 000 mOsm/kg，添加了過多的輔料可能是該企業產品滲透壓高的原因。各企業樣品中均檢出硫酸根離子，可能是原料及工藝中帶入的，對比果糖二磷酸鈉原料質量標準中檢查項下硫酸根的限度0.05%，有1 家企業抽檢的21 批樣品中，17 批超過限度。其余4 家企業的27 批樣品，硫酸根含量結果均遠小于0.05%。提示生產工藝中可能帶入一定量的硫酸根。

3.2.8 加速穩定性考察本研究選取了5 家生產企業7 批注射液分別放置在30 ℃、40 ℃及50 ℃進行了連續8 周的穩定性實驗，考察項目為游離磷酸鹽與含量測定。

結果發現該產品對熱不穩定，如圖2、圖3 所示，隨著溫度的升高，其降解的速度越快。30 ℃條件下，放置4 周內比較穩定，8 周內游離磷酸鹽逐漸增加，果糖二磷酸鈉含量緩慢下降；40 ℃條件下，放置到第4 周游離磷酸鹽明顯增加，部分批次超限，果糖二磷酸鈉含量出現較為明顯的下降；50 ℃條件下，放置1 周游離磷酸鹽全部超限，放置2 周，果糖二磷酸鈉含量明顯下降。

圖2 游離磷酸鹽含量和時間的關系

圖3 果糖二磷酸鈉含量和時間的關系

使用Prism 6 統計計算分析結果，游離磷酸鹽在30 ℃、40 ℃、50 ℃時均與時間存在顯著相關（P<0.01）。含量與時間在30 ℃時無顯著相關，在40 ℃、50 ℃時存在顯著性相關（P<0.01）。提示溫度是產品質量的主要影響因素。

3.2.9 模擬滅菌工藝質量考察根據調研了解到保證果糖二磷酸鈉注射液無菌的主要方式有無菌生產工藝和熱處理輔助加過濾除菌。取果糖二磷酸鈉原料和輔料，按配比制成果糖二磷酸鈉溶液，密封，分別在121 ℃和100 ℃高溫滅菌15 min，60 ℃加熱1 h。監測滅菌前后該批次樣品中果糖二磷酸鈉含量和游離磷酸鹽變化。原料含量99.30%，游離磷酸鹽為0.15%。121 ℃滅菌15 min，游離磷酸鹽均上升至9.9%以上，含量降至65%；100 ℃滅菌15 min后游離磷酸鹽迅速增加2.2%，含量降至83%；在60 ℃加熱1 h，游離磷酸鹽含量上升至0.89%，含量降低到97%。要保證F0 值不低于8 min，又要確保滅菌后SAL≤10-6，采用加熱滅菌工藝難度很大。

4 討論

4.1 通過質量分析發現的問題

4.1.1 標準檢驗發現的主要問題（1）現行標準可行性和有效性方面存在一定問題，如薄層色譜鑒別時經常出現Rf 值小，樣品展開不完全，且有點樣量過高，拖尾嚴重的情況，方法條件需要進一步優化；注射用粉針有關物質薄層色譜檢查項下，按標準要求的點樣量，斑點不明顯，方法可行性較差，需要進一步改進。（2）現行質量標準中安全性指標部分缺失，如未對有關物質、滲透壓摩爾濃度、鋁離子和抗氧劑等進行控制。有關物質是反映產品質量的一個重要指標，是生產工藝和儲存條件是否合理的重要依據；滲透壓摩爾濃度可以反映產品的質量情況，滲透壓摩爾濃度過高會引起注射疼痛甚至溶血；金屬鋁作為一種對人體有害的元素，在體內可造成蓄積，大容量注射液中的鋁離子直接進入體內，風險較大；抗氧劑作為重要輔料，在注射液中的添加可能引起副作用。建議增加以上安全性指標，對現行標準進行完善。

4.1.2 生產工藝對產品質量影響較大滅菌工藝的選擇對產品質量至關重要；檢驗結果表明果糖二磷酸鈉對熱不穩定，故生產工藝不宜采用終端滅菌或是熱處理等輔助滅菌工藝；采用無菌生產工藝生產的產品其產品質量相對較好，采用熱處理輔助滅菌方式的2 家企業按標準檢驗均出現了不合格的產品。

4.1.3 原輔料的選擇對終端產品質量影響大果糖二磷酸鈉產品質量與原料的質量好壞密切相關，注射用粉針采用原料直接分裝，原料的質量控制很大程度上影響終產品的質量。探索性研究中發現質控水平高的原料生產出來的制劑相應產品質量較好，如采用鋁含量低的原料生產的終產品鋁含量也相對較低；制劑生產過程中應嚴格把控輔料的添加，如添加過多的Cl-可能導致滲透壓的增高；注射液中添加焦亞硫酸鹽作為抗氧劑易引起過敏等副反應［10］。

4.1.4 貯存條件對產品質量影響較大該產品要求在密封，在陰涼處（不超過20 ℃）貯藏，但是在實際使用過程很難保證。此次評價性抽驗結果發現不合格的產品均在流通領域及醫療單位，果糖二磷酸鈉注射液同一批次不同地點抽樣產品檢驗結果存在顯著差異。不合格的原因不排除是由于貯存或運輸條件不當造成的。

4.2 評價與建議

4.2.1 質量總體評價通過標準檢驗和探索性研究結果分析，注射用果糖二磷酸鈉產品質量總體一般；注射液由于劑型和生產工藝等問題，不合格率較高，整體質量較差。標準檢驗中果糖二磷酸鈉注射液55批次產品共10 批次不合格，不合格率為18.2%；注射用果糖二磷酸鈉63 批次產品有1 批次不合格，不合格率為1.6%。進一步探索性研究中果糖二磷酸鈉注射液55 批次產品共36 批次不合格，不合格率達到65.5%；注射用果糖二磷酸鈉63 批次產品共10 批次不合格，不合格率為15.9%。

4.2.2 建議（1）建議加快標準提高的進度，提高相關質量控制水平；在現有注射用果糖二磷酸鈉質量標準基礎上，改進鑒別、有關物質檢查的方法，增加滲透壓摩爾濃度及鋁含量等項目；在現有果糖二磷酸鈉注射液標準上增加滲透壓摩爾濃度、有關物質及鋁含量等項目。（2）建議監管部門對果糖二磷酸鈉注射液原輔材料及處方工藝進行專項核查；建議企業加強原輔料的質量控制，考察處方的合理性。加強關鍵工藝指標（滅菌工藝）的質量控制，規范生產工藝及相關驗證，確保藥品按合法的工藝進行生產。（3）建議針對此類對儲存溫度有特殊要求的樣品，應加強使用終端貯存條件的控制，強調抽樣及運輸時保存條件，進一步加強對此類熱不穩定樣品在流通環節的監控。

綜上所述，果糖二磷酸鈉注射劑質量狀況存在不足，現行標準已不能滿足現階段對產品質量有效控制的基本要求，在項目制定、方法選取等方面需提高。此外，建議生產企業嚴格控制生產環境，改進生產工藝，提高產品質量，以降低使用風險，保障人民用藥安全。