韭蓮總生物堿分離純化工藝研究

侯雄軍，吳文明，羅天澤，沈成英，杜超穎，胡建新

1.江西省人民醫院，南昌醫學院第一附屬醫院，江西 南昌 330006；2.南昌大學藥學院，江西 南昌 330031

韭蓮（Zephyranthes carinata）為石蒜科（Amaryllidaceae）蔥蓮屬（Zephyranthes）植物［1］，又名風雨蘭、紅玉簾、韭蘭，原產于南美，在我國南方及長江流域廣泛栽培。韭蓮全草均可入藥，具有良好的散熱解毒、活血消腫、涼血止血的功效。韭蓮主要次生代謝產物為生物堿［2-3］，是其主要的活性成分，具有抗炎、抗病毒、鎮痛、鎮靜、抗癌等生理活性［1］，其中石蒜堿是最具特征性的成分。現代醫學研究表明，石蒜堿具有良好的抗腫瘤、抗菌、抗寄生蟲、抑制乙酰膽堿酯酶等活性［4-9］。因此，韭蓮總生物堿的分離純化工藝研究，對于其藥效的物質基礎開發利用顯得尤為重要。本研究以石蒜堿作為含量測定的指標，對大孔吸附樹脂分離純化韭蓮總生物堿的工藝進行系統考察與優化，優選出大孔吸附樹脂分離純化韭蓮總生物堿的最佳工藝，進而制備出生物堿含量較高的韭蓮有效部位，為后續的研究奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U-T9 紫外可見分光光度計（上海屹譜儀器制造有限公司）、PD-1E-50 型冷凍干燥機（長沙巴躍儀器有限公司）、RE-2000B 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、FBC1002 型超純水機（青島富勒姆科技有限公司）、METTLER TOLEDO AE240 型電子分析天平（中國梅特勒-托利多儀器廠）。

1.2 試藥

韭蓮藥材購于云南曲靖，經江西中醫藥大學馮育林教授鑒定為正品；石蒜堿標準品（上海源葉生物科技有限公司，批號：R17J10F93289，含量≥98%）；D101、AB-8、HPD300、NKA-9、ADS-7、DM130 大孔吸附樹脂（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為：D20GS171830、N03GS165685、S15GS160858、A05GS144103、B17O10E100047、L07D11X133496）；甲醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色譜級），無水乙醇（食用級），水為超純水。

2 方法與結果

2.1 石蒜堿含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備精密稱取石蒜堿對照品12.80 mg，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得1.280 mg/mL 的對照品儲備液，再用甲醇將該儲備液稀釋為不同濃度（0.128、0.064、0.032、0.016、0.008、0.004、0.002 mg/mL）的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備精密稱取韭蓮對照藥材粉末1.0 g，用70 %乙醇加熱回流提取3 次，每次50 mL回流2 h，合并3 次提取液，減壓濃縮至干，用70%乙醇復溶，轉移至50 mL 容量瓶中，并定容至刻度。

2.1.3 檢測波長的選擇取石蒜堿對照品溶液和供試品溶液，于200～600 nm 范圍內全波長掃描。結果顯示，兩者吸收圖譜相似，對照品和供試品在215、292 nm 處有較強吸收。因215 nm 處，溶劑效應較強，故選擇292 nm 作為檢測波長。

2.1.4 標準曲線繪制取“2.1.1”項下不同濃度的對照品溶液，以相應溶劑作空白校正，于292 nm 處測定各濃度對照品溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標（Y），溶液濃度為橫坐標（X），建立回歸方程，得Y=10.611X+0.004 4，R2=0.999 6（n=7），結果表明，石蒜堿濃度在0.002～0.128 mg/mL 范圍內與吸光度具有較好的線性關系，見圖1。

圖1 石蒜堿標準曲線

2.2 韭蓮總生物堿純化工藝研究

2.2.1 上樣液的制備稱取韭蓮藥材粗粉500 g，加熱回流提取3 次（10 倍量70%乙醇），每次2 h，提取液用100 目篩網濾過，濾液減壓濃縮至無醇味，用純化水定容至2 500 mL，超聲溶解1 h，然后3 000 r/min 離心10 min，取上清液作為供試品原液。經含量測定，供試品原液中總生物堿的含量為2.656 mg/mL。

2.2.2 靜態吸附試驗精密稱取各型號已處理好的大孔吸附樹脂1.0 g，置于50 mL 錐形瓶中，加入30 mL供試品原液，用保鮮膜密封，恒溫振蕩吸附24 h，精密吸取100 μL 溶液轉移至2 mL 容量瓶中，用純水定容至刻度，測定總生物的含量，計算靜態飽和吸附量，結果見表1。

2.2.3 解吸附試驗取已吸附好的樹脂，濾過，用少量純化水潤洗，吸干表面水分，加入70%乙醇30 mL，用保鮮膜密閉，恒溫振蕩解吸附2 h，精密吸取100 μL 溶液轉移至2 mL 容量瓶中，用純水定容至刻度，測定總生物的含量，計算解吸率，結果見表1。

表1 不同型號樹脂靜態吸附、解吸附性能比較

由表1 結果可知，上述6 種樹脂中，HPD300大孔吸附樹脂靜態飽和吸附量和解吸率均較優，因此本實驗選用HPD300 大孔吸附樹脂作為韭蓮提取液總生物堿純化工藝研究的樹脂。

2.2.4 靜態吸附動力學曲線精密稱取HPD300 大孔吸附樹脂1.0 g，置于50 mL 錐形瓶中，加入供試品原液30 mL，用保鮮膜密封，恒溫振蕩吸附，分別于5、10、30、60、120、180、240、480、640、960、1 440 min 精密吸取100 μL 溶液轉移至2 mL 容量瓶中，用純水定容至刻度，測定各時間點總生物的含量，繪制HPD300 大孔吸附樹脂對韭蓮總生物堿的吸附動力學曲線，見圖2。

圖2 靜態吸附動力學曲線

由圖2 結果可知，靜態吸附240 min 后，HPD300大孔吸附樹脂對韭蓮提取液總生物堿的吸附基本達到飽和；靜態吸附640 min 后，已達最大吸附率的97 %以上。綜合吸附效果和時間因素，本實驗選擇240 min 作為靜態吸附時間。

2.2.5 上樣濃度考察精密稱取6 份已處理好的HPD300 大孔吸附樹脂9.8 g，柱體積（Bed volume,BV）為10 mL，濕法裝柱。量取6 份韭蓮提取液，每份40 mL，分別加入適量的純化水，使稀釋后提取液中總生物堿的質量濃度分別為0.664、0.885、1.328、1.593、1.992、2.656 mg/mL，上柱動態吸附，收集流出液，并測定其中總生物堿的泄漏量，繪制動態吸附曲線，結果見圖3。

圖3 上樣濃度對吸附效果的影響

由圖3 的結果可知，當上樣濃度為0.664～1.328 mg/mL時，上樣流出液中生物堿的泄露量隨濃度的增加而減少；濃度為1.328～1.593 mg/mL 時泄漏量降至最低，隨后隨濃度升高，泄漏量又逐步增加。因此上樣濃度控制在1.328～1.593 mg/mL 之間時，吸附量最佳。

2.2.6 上樣流速考察精密稱取5 份已處理好的HPD300 大孔吸附樹脂9.8 g（柱體積為10 mL），濕法裝柱。量取稀釋好的韭蓮提取液5 份，每份80 mL，分別以1、2、3、4、5 BV/h 的流速上柱，進行動態吸附，收集流出液，并測定其在292 nm 波長下的吸光度，結果見圖4。

圖4 上樣流速對吸附效果的影響

由“2.1.4”標準曲線結果可知，上樣流出液的吸光度值與其總生物堿含量為正向線性關系。因此，可通過觀察其吸光度與上樣流速之間的關系來推測其總生物堿含量與上樣流速之間的關系。由圖4 可知，上樣流出液中總生物堿的含量與上樣流速之間成正相關，當上樣流速為1、2、3 BV/h 時，上樣流出液中總生物堿含量增幅相對平緩，綜合考慮吸附效果和時間因素，本實驗選擇2 BV/h 作為上樣流速。

2.2.7 最大上樣量考察精密稱取已處理好的HPD300大孔吸附樹脂9.8 g（柱體積為10 mL），濕法裝柱，取稀釋好的韭蓮提取液，以2 BV/h 的流速上柱進行動態吸附，每5 mL 收集一管，測定上樣流出液中總生物堿的濃度，泄露曲線見圖5。

圖5 動態吸附泄露曲線

由圖5 結果可知，當上樣體積大于10 BV 時，上樣流出液中總生物堿的濃度開始升高；上樣體積大于22 BV 時，上樣流出液中總生物堿的含量顯著增高。為減少損失，提高樣品回收率，本實驗采用10 BV 作為最大上樣量。

2.2.8 梯度洗脫試驗精密稱取已處理好的HPD300大孔吸附樹脂9.8 g（柱體積為10 mL），濕法裝柱，取稀釋好的韭蓮提取液100 mL，以2 BV/h 的流速上柱進行動態吸附，上樣完后，靜置吸附4 h。然后，依次用8 BV 水，8 BV 10%、30%、50%、70%、95%乙醇洗脫，洗脫流速2 BV/h，每10 mL 收集一管洗脫液，測定每管洗脫液中總生物堿的含量，梯度洗脫曲線見圖6。

圖6 韭蓮總生物堿梯度洗脫曲線

試驗結果顯示，水洗至6 BV 時，洗脫液已經無色，此時水洗液中生物堿含量已經非常低。由圖6 結果可知，水洗液和95 %乙醇洗脫液中生物堿含量較少，生物堿類成分主要分布在10 %、30 %、50 %、70 %洗脫液中。故將韭蓮總生物堿的純化工藝初定為：先用6 BV 水洗脫至流出液無色，再用70 %乙醇洗脫。

2.2.9 醇洗脫體積考察精密稱取已處理好的HPD300大孔吸附樹脂9.8 g（柱體積為10 mL），濕法裝柱，取稀釋好的韭蓮提取液100 mL，以2 BV/h 的流速上柱進行動態吸附，上樣完后，靜置吸附4 h。然后，先用6 BV 的水洗脫至流出液無色，然后用70%乙醇洗脫，洗脫流速2 BV/h，分段收集洗脫液，測定其中總生物堿含量，洗脫曲線見圖7。

由圖7 結果可知，5 BV 的70 %乙醇基本能把韭蓮總生物堿洗脫完全，之后隨洗脫體積的增加，洗脫液中生物堿的含量極少，故確定70 %乙醇洗脫體積為5 BV。

2.2.10 洗脫流速考察精密稱取已處理好的HPD300大孔吸附樹脂9.8 g（柱體積為10 mL），5 份，濕法裝柱。量取稀釋好的韭蓮提取液5 份，每份100 mL，以2 BV/h 的流速上柱，進行動態吸附，上樣完后，靜置吸附4 h。按上述優化方案，分別以1、2、3、4、5 BV/h 的流速洗脫，收集洗脫液，測定其中總生物堿的含量，計算洗脫量，結果見表8。

由圖8 結果可知，隨著洗脫流速的增加，洗脫量逐步降低。由于洗脫流速為1 BV/h 和2 BV/h 時，洗脫量變化不大，而采用1 BV/h 洗脫耗時較長，因此，確定最佳洗脫流速為2 BV/h。

圖8 洗脫流速考察結果

綜上所述，采用HPD300 大孔吸附樹脂純化韭蓮提取液中總生物堿的最佳工藝為：上樣提取液濃度1.328～1.593 mg/mL，上樣流速2 BV/h，上樣后靜態吸附4 h，先用6 BV 水洗脫至無色，再用5 BV 70 %乙醇洗脫，洗脫流速2 BV/h，收集洗脫液，減壓濃縮后凍干。

2.2.11 驗證試驗采用上述優選的純化工藝，進行3 批次的驗證試驗，收集洗脫液，減壓濃縮后凍干，測定凍干粉中總生物堿的含量。結果顯示，三批次樣品70 %乙醇洗脫部位凍干粉總生物堿含量分別為65.63%、70.42%、66.80%，平均含量為67.62%（RSD=2.50%），表明HPD300 大孔吸附樹脂對韭蓮總生物堿的分離純化效果良好，且純化條件簡單，重現性好。

3 討論

中藥由于具有多通路、多成分、多靶點綜合作用的特點，在臨床上擁有獨特優勢。因此，如何使中藥有效部位更加富集，提高活性成分的含量，是提高中藥臨床療效的關鍵技術問題。韭蓮的主要化學成分是生物堿，現已從韭蓮中分離出包括石蒜堿、加蘭他敏、Haemanthidine 等幾十種生物堿［2］。當前對這些生物堿藥理作用研究較多［10-11］，但未見有韭蓮總生物的分離純化工藝研究。因此，基于中藥的多通路、多成分、多靶點作用的特點，本研究以石蒜堿為指標，對韭蓮總生物堿的分離純化工藝做了系統研究。

大孔吸附樹脂是一種具有大孔網狀結構的有機高聚吸附劑，比表面積大，對多種常見中藥有效成分均具有良好的選擇吸附性，相較于其他傳統分離工藝，具有成本低，吸附容量大、速度快，穩定性高，可反復使用等優點［12］，在中藥有效成分的分離純化領域已得到廣泛應用。目前，通過樹脂來進行生物堿的純化仍是主要手段之一，針對不同中藥中生物堿類化合物的性質，選擇合適的大孔吸附樹脂，不斷研究開發全新的、分離效果更優的純化工藝，推動實驗室成果轉化，有利于促進我國中藥產業的健康發展，充分挖掘中藥產業的巨大社會效益、生態效益潛力［13］。極性是決定大孔吸附樹脂對不同有機物吸附能力的關鍵因素，選擇合適極性的樹脂對中藥有效成分的分離純化至關重要。基于此，本研究結合樹脂性能和參考文獻選擇了6 種不同極性的大孔吸附樹脂，并比較它們對韭蓮生物堿的吸附與解吸附性能，發現HPD300 大孔吸附樹脂對韭蓮總生物堿的分離純化效果良好，且純化條件簡單，重現性好，為進一步研究開發韭蓮生物堿奠定了基礎。