非洲豬瘟病毒MGF505-3R蛋白的原核表達(dá)研究

王鳳杰，魏 天，張芳毓，王成宇，張守峰，扈榮良，呂禮良，王永志

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院長春獸醫(yī)研究所，吉林長春 130122；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林長春 130124

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要通過蜱傳播。該病以呼吸障礙，全身出血為主要臨床特征，病程短，發(fā)病率和死亡率高達(dá)100%。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報告疫病，我國將其列為一類傳染病。

ASFV是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，是由共價封閉的雙鏈DNA分子組成的具有線性基因組的二十面體DNA病毒，直徑為175～215 nm，基因組在170～193 kb之間，共編碼150～200個開放閱讀框（ORFs）。ASFV基因組中約30%的ORFs存在多個拷貝，即多基因家 族，包 括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505/530。其中MGF505基因家族包括MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R，它們在病毒的感染過程中發(fā)揮著重要作用。有研究表明MGF505與病毒的復(fù)制及毒力有關(guān)，敲除ASFV強(qiáng)毒株或弱毒株MGF505的某些基因，會大大降低病毒在巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制效率，除此之外，MGF505的編碼蛋白也可抑制正常I型干擾素的表達(dá)[1]。本研究成功構(gòu)建出MGF505-3R重組質(zhì)粒并在大腸桿菌中原核表達(dá)，純化后得到純度較高M(jìn)GF505-3R重組蛋白，為MGF505蛋白的研究奠定了基礎(chǔ)，為ASFV MGF505基因缺失疫苗相關(guān)免疫學(xué)方面的鑒別檢測和診斷提供前期技術(shù)支持。

1 材料

1.1 質(zhì)粒、ASFV陽性血清

AFSV基因組DNA、ASFV陽性血清均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所保存。

1.2 主要試劑

ExTaq DNA聚合酶、DNA Marker、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、In-fusion HD? Cloning kit連接試劑盒，均購自TaKaRa公司；兔抗鼠HRP-IgG，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；IPTG異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，購自長春飛凱生物有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自天根生化（北京）科技有限公司； Transetta（DE3）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 引物設(shè)計

依據(jù)GenBank上非洲豬瘟病毒MGF505-3R（登錄號:NC_044959.1）基因序列，利用Lasergene 7.1設(shè)計具有酶切位點、His標(biāo)簽和同源臂的特異性引物。

引物序列：F5’-TGGGATCCCCGGAATTCATGTCCTC TTCTCTTCAGGAAC -3’，R5’-CGATGCGGCCGCTCGAGC TAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCTTTCCCAGGTTTCGA AG-3’。

2.2 MGF505-3R基因的擴(kuò)增、鑒定

以軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所保存的非洲豬瘟基因全序列質(zhì)粒為模板，PCR反應(yīng)體系（20 μL）：上、下游引物（10 pmol/μL）各1 μL，ExTaq DNA Polymerase Mix 10 μL，模板0.5 μL，加雙蒸水補至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

2.3 MGF505-13L原核表達(dá)載體的構(gòu)建

使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收2.2步驟的PCR產(chǎn)物。使用限制性內(nèi)切酶Xho I和EcoR I酶切pGEX-6p-1原核表達(dá)載體并回收DNA。使用Super Fusion Cloning Mix（2×）連接酶將MGF505-3R基因片段和pGEX-6p-1原核表達(dá)載體連接。將連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Transetta（DE3）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落經(jīng)PCR初步驗證后，陽性克隆由吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。

2.4 MGF505-3R重組蛋白的原核表達(dá)及SDS-PAGE分析

取50 μL MGF505-3R陽性菌液按1:1 000接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素100 μg/mL），37 ℃震蕩培養(yǎng)12～16 h；將擴(kuò)增好的菌液按照1:100的比例加入LB液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素100 μg/mL），37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD=1時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃搖床震蕩誘導(dǎo)2 h。分別將誘導(dǎo)前后的菌液離心，用無菌水重懸菌體，冰水浴超聲破碎菌體，4 500 r/min 4 ℃離心15 min后收集上清液和沉淀。分別取80 μL上清液和沉淀與20 μL 5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混合，沸水浴5 min，冰水浴5 min，12 000 r/min 4 ℃ 離心2 min；取10 μL上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測，考馬斯亮藍(lán)染色后分析目的蛋白的表達(dá)情況。

2.5 MGF505-3R重組蛋白的純化

通過SDS-PAGE分析顯示，MGF505-3R重組蛋白以包涵體形式表達(dá)。包涵體沉淀用1×PBST緩沖液洗滌后溶解于pH 8.0的8 mol/L尿素，12 000 r/min離心10 min收集上清液，上清液用0.45 μm濾膜過濾后加入已經(jīng)平衡好的Ni-NTA瓊脂糖親和層析柱，流速1 mL/min，收集濾液，重復(fù)3次循環(huán)加入層析柱，用pH6.0的8 mol/L尿素洗滌雜蛋白，用pH4.0的8 mol/L尿素洗脫目的蛋白。將純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。通過BCA法測定蛋白濃度。

2.6 Western-blot鑒定

將純化后的重組蛋白凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜，以5%脫脂奶粉封閉，使用1:5 000倍稀釋的ASFV陽性血清孵育1 h，洗滌5次；以HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗1:10 000稀釋后孵育1 h，洗滌5次；加入DAB顯色，觀察重組MGF505-3R蛋白的反應(yīng)原性。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR的檢測結(jié)果

對MGF505-3R基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1% 的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，擴(kuò)增片段與目的片段（843 bp）大小一致。

3.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與測序鑒定

將載體pGEX-6p-1酶切產(chǎn)物和MGF505-3R的PCR產(chǎn)物經(jīng)In-fusion HD? Cloning kit連接試劑盒連接，轉(zhuǎn)化至Transetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單菌落PCR驗證，陽性克隆由庫美生物公司測序。測序結(jié)果使用seqman軟件分析，結(jié)果表明該序列與GenBank中收錄的MGF505-3R基因序列的相似性為99%，成功引入His標(biāo)簽，且編碼框插入正確。

3.3 MGF505-3R重組蛋白的原核表達(dá)及SDS-PAGE分析

利用鑒定為陽性的MGF505-3R原核表達(dá)菌株進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎菌體后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示，MGF505-3R重組蛋白主要在沉淀中以包涵體的形式表達(dá)，蛋白條帶大小為53 ku符合預(yù)期值。

3.4 MGF505-3R重組蛋白的純化及SDS-PAGE分析

使用包涵體常規(guī)純化方式對MGF505-3R重組蛋白進(jìn)行Ni-NTA瓊脂糖親和層析純化，獲得純度較高的目的條帶。

3.5 Western-blot分析

抗ASFV抗體與轉(zhuǎn)染到Pvdf膜上的MGF505-3R重組蛋白可以反應(yīng)，以ASFV同樣具有GST和His雙標(biāo)簽的重組P72蛋白為陽性對照，植物病毒蛋白為陰性對照，經(jīng)DAB顯色后，在53 ku處有一條明顯特異性條帶，表明重組蛋白具有良好的表達(dá)活性。

4 討論

ASFV具有龐大的基因組，可編碼多種蛋白質(zhì)，擁有十分復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制。MGFs約占ASFV基因組ORFs的30%，編碼的多個拷貝，為病毒提供了選擇進(jìn)化的優(yōu)勢，盡管單個MGF基因的功能是未知的，但已有研究顯示MGF360和MGF505是促進(jìn)感染細(xì)胞存活和抑制I型干擾素反應(yīng)所必需的基因[2]。針對MGFs基因缺失疫苗的研究也是目前ASF疫苗研制的主要研究方向。

原核表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早，應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)，與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，其優(yōu)點在于方法簡單、用時短、而且所需的成本低廉。但蛋白產(chǎn)物由于沒有真核生物的修飾，不一定具有天然的活性。蛋白也常以包涵體的形式表達(dá)，不易提取。本研究將目的基因克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6p-1上，轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株Transetta（DE3）中進(jìn)行體外誘導(dǎo)表達(dá)，實現(xiàn)了目的基因的高效表達(dá)，但目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，不具有生物學(xué)活性，除了與復(fù)性過程性質(zhì)相關(guān)外，還與蛋白質(zhì)本身特性有關(guān)。

本實驗成功克隆出引入His標(biāo)簽的MGF505-3R基因片段，以pGEX-6p-1為載體構(gòu)建出帶有GST、His雙標(biāo)簽的MGF505-3R重組質(zhì)粒，原核表達(dá)并純化，獲得純度較高的MGF505-3R重組蛋白，Western-blot對重組蛋白進(jìn)行血清學(xué)分析，檢測出其具有良好的表達(dá)活性。本實驗為MGF505蛋白的后續(xù)研究打下了基礎(chǔ)，為ASFV MGF505基因缺失疫苗相關(guān)免疫學(xué)方面的檢測提供前期技術(shù)儲備。