紫外消毒對養殖廢水中大腸桿菌的滅活及影響因素

陳世珩，呂兆豐，鄭添予，宗玉國，王道武*

1.長春工業大學化學工程學院，吉林長春 130012；2.延邊大學，吉林延吉 133400；3.山東省濰坊市臨朐縣綜合行政執法局，山東濰坊 261000

大腸桿菌廣泛寄生于人與動物體腸道的條件致病菌，感染性很強，宿主受感染后易引發多種臨床癥狀[1]。近年來大腸桿菌在不同環境中的傳播均被報道過，包括食物、食用動物、不同的水環境尤其是污水中的傳播。隨著養殖業的快速發展，動物源大腸桿菌，特別是攜帶抗性基因的致病性的大腸桿菌對環境污染造成的危害日益突出。大腸桿菌可寄生于動物呼吸道或消化道上皮細胞中，是導致腹瀉的重要病原之一。養殖業動物感染大腸桿菌后主要急性病例一般1～2 d死亡，亞急性1周左右死亡。體溫正常或偏低。大腸桿菌在水環境中的潛伏期較長，可存活數月至一年之久。養殖廢水中存在著大量抗生素耐藥型病菌，是造成畜牧養殖業疾病的主要來源之一。大腸桿菌作為環境條件下的指示性微生物，可以間接反映水環境中的病菌污染程度。近些年，隨著紫外滅活技術在不同領域的研究深入，發現紫外線消毒對不同種類細菌的影響具有差別性，例如革蘭氏陽性菌對紫外線的耐受性高于革蘭氏陰性菌[2]。

本研究選取了從養殖廢水中分離純化的多藥耐藥大腸桿菌，考察了紫外線對不同耐藥表型大腸桿菌的滅活效果及環境因素對其影響因素，尋求高效、可行的控制水中大腸桿菌的方法和工藝，對推進大腸桿菌滅活的科學研究和技術開發有著非常積極的價值和意義[3]。

1 實驗材料

1.1 菌株

所用大腸桿菌Ecoil.322鑒定為多藥耐藥大腸桿菌，耐藥表型見表1。Ecoil.201（抗生素敏感菌株，由吉林畜牧提供）。

表1 大腸桿菌Ecoil.322耐藥表型

Ecoil.322對β-內酰胺、頭孢菌素、氨基糖苷、抗葉酸、喹諾酮、大環內酯、四環素、苯丙醇類等8類14種抗生素均有耐藥性，僅對磺胺異惡唑表現為中介，對呋喃妥因表現為敏感（表1）。MIC檢測結果表明Ecoil.322呈多重耐藥，且耐藥性嚴重。

1.2 培養基的配制

營養瓊脂：取50 g營養瓊脂粉，加入100 mL的蒸餾水與燒杯中，用玻璃攪拌充分后，封口燒杯放置高溫滅菌鍋中，設置121 ℃滅菌65 min，冷卻50 ℃后緩慢倒入培養皿中，待至冷卻。

LB肉湯（Luria-Bertani broth）的配制：稱取150 g的營養瓊脂粉，加入500 mFL的蒸餾水與燒杯中，用玻璃攪拌充分后，放置高溫滅菌鍋中，設置121 ℃滅菌65 min，冷卻至室溫后用無菌玻璃管進行分裝。

1.3 實驗裝置

試驗裝置如圖1所示．低壓UVC燈為江蘇南京胥光燈管，波長254 nm，功率為14 W[4]，裝置下面暗室裝有直徑為40 cm的圓型轉盤放置大腸桿菌樣品，水槽及暗箱（外部封有錫紙）均為導光板[5]，可以控制中間的透鏡來調控紫外強度。

圖1 紫外實驗裝置圖

2 實驗方法

2.1 紫外線消毒實驗

2.1.1 實驗菌株的制備

分別挑選菌株接種于5 mL液體肉湯培養液中，于培養箱中37 ℃振蕩過夜。24 h后，于菌液置4 ℃，10 000 r/min離心10 min，取沉淀用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7.2）沖洗沉淀1～2次，轉入100 mL的蒸餾水后，顯微鏡下用血球計數板計數，制成大腸桿菌濃度約107CFU/mL的菌液樣品。

2.1.2 紫外消毒實驗

取3.5 mL大腸菌液樣品于半徑40 mm的滅菌培養皿中，放置在實驗設備的暗箱室中。經紫外輻射強度儀測定輻照強度為100 μW/cm2，通過控制樣品的輻射時間來獲得不同紫外劑量。取時間間隔2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 min收集樣品。每組實驗進行3次重復性實驗保證實驗準確性，紫外消毒前后樣品通過營養瓊脂平板計數法測定大腸桿菌的濃度。滅活對數R的計算公式如下：

式中，N0是未經紫外線消毒時（原始）樣品中的大腸桿菌濃度（CFU/mL）；NI是某一劑量紫外線消毒后樣品中大腸桿菌的濃度（CFU/mL）。

2.1.3 不同環境因素對紫外線消毒效果影響試驗

通過2.1.2節的實驗，確定最佳的不同種類大腸桿菌滅活輻射劑量，以及在養殖廢水常見水域環境條件下選擇分別選定pH5、6、7、8、9，Cu2+濃度分別為15、30、60 mg/L。探究不同pH、離子強度濃度對紫外線的影響。

3 實驗結果與討論

3.1 相同紫外輻射劑量對不同大腸桿菌菌株的滅活

控制溫度為22±1 ℃，濁度為1 ntu的實驗條件下，耐藥型和敏感型大腸桿菌的滅活對數均隨著紫外輻射劑量的增加而增加，在紫外劑量輻射0～15 mj/cm2內增長十分迅速，之后逐漸緩慢，在到達20 mj/cm2后沒有變化，在15 mj/cm2的輻照劑量下，大腸桿菌Ecoil.201和Ecoil.322的對數滅活率均值分別為2.12 log和1.82 log，之間有較為顯著的差異。盡管耐藥型大腸桿菌較敏感型大腸桿菌滅活速率較低，但20 mj/cm2以上的紫外線輻照劑量時，兩株大腸桿菌對數滅活率都在2.0 log左右。以上，不同菌株滅活率的差異主要表現在低輻照劑量下。

3.2 pH對大腸桿菌紫外滅活的影響

控制溫度為22±1 ℃，濁度為1 ntu的實驗條件下，探究不同pH對紫外滅活的影響。在實驗范圍內隨著pH的增加，滅活對數絕對值增加，堿性條件有一定促進大腸桿菌紫外滅活，酸性條件下抑制其紫外滅活，與大腸桿菌卵囊在不同環境下活性相關。在紫外劑量到達15 mj/cm2的時候，各個條件下滅活對數級都達到了1.5個對數級。因此，pH的改變對紫外條件下大腸桿菌的滅活有一定的影響，堿性條件下有一定的促進作用。

3.3 Cu2+離子對大腸桿菌紫外滅活的影響

控制溫度為22±1 ℃，濁度為1 ntu的實驗條件下，探究Cu2+不同濃度對紫外滅活的影響。水中金屬離子強度對紫外滅活大腸桿菌的影響為，Cu2+濃度對滅活效率的影響可以忽略不計。隨著Cu2+濃度從15 mg/L增加到60 mg/L，紫外滅活效率在10 mj/cm2內沒有顯著變化。總體而言，水中堿性金屬離子的存在對紫外滅活大腸桿菌無明顯影響。

4 小結

通過對養殖廢水中篩選出的1株不同耐藥表型的大腸桿菌和1株對抗生素敏感大腸桿菌進行紫外線消毒試驗，取得以下結果。

4.1 耐藥型和敏感型大腸桿菌的滅活對數均隨著紫外輻射劑量的增加而增加，在紫外劑量輻射0～15 mj/cm2內增長十分迅速，之后逐漸緩慢，在到達20 mj/cm2后無顯著變化，在15 mj/cm2的輻照劑量下，大腸桿菌Ecoil.201和Ecoil.322的對數滅活率均值分別為2.12log和1.82log，之間有顯著的差異。當紫外輻射劑量為20 mj/cm2，對菌株Ecoil.322的滅活率為99.5%，菌株Ecoil.201的滅活率為99.1%，無顯著差異。

4.2 隨著pH升高，紫外滅活效率隨著升高，pH降低對滅活有明顯的抑制作用，滅活對數速率常數從0.00786下降到0.00382。

4.3 Cu2+離子不干擾紫外對隱孢子蟲的滅活效率，隨著Cu2+濃度從15 mg/L增加到60 mg/L相應的離子強度分別從40 mM增加到80 mM，紫外滅活效率在20 mj/cm2內沒有顯著變化。