支架內再狹窄非編碼核糖核酸靶向治療研究進展

丁婷婷， 暢智慧， 劉兆玉

下肢動脈硬化閉塞癥（arteriosclerosisobliterans，ASO）是由動脈粥樣硬化引起的動脈閉塞性疾病［1］。血管內支架植入術可明顯改善下肢ASO患者缺血引發的間歇性跛行和靜息痛等癥狀。然而支架作為外源性物質，植入體內會造成血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）異常增殖和遷移、內皮細胞（endothelial cell，EC）損傷、炎性反應和新內膜形成等一系列并發癥，導致支架內再狹窄（in-stent restenosis，ISR）形成［2］。研究顯示，非編碼核糖核酸（non-coding ribonucleic acid，ncRNA）在調節VSMC和EC生物學功能及炎性反應等方面具有巨大潛力。通過調節靶區域ncRNA分布進而調節VSMC和EC功能，可減少支架植入引起的損傷，降低ISR發生率［3］。

ncRNA共同特征是，可從基因組中轉錄，但不能翻譯成蛋白質，并可在核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）水平發揮生物學功能［4］。根據ncRNA大小，通常可分小分子ncRNA和大分子ncRNA兩類。小分子ncRNA包括微RNA（miRNA）、Piwi蛋白相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）、環狀RNA（circular RNA，circRNA）、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）等，大分子ncRNA包括核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、天然反義轉錄物（natural antisense transcript，NAT）和長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）［5］。近年研究證明，ncRNA在ISR過程中對白細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞有調節作用，可調控VSMC和EC等細胞增殖、遷移、凋亡及免疫反應等過程，對治療ISR也具有潛在的臨床干預靶點［6］。但目前ncRNA作為生物標志物用于ISR治療仍有很多研究要做。

1 ISR病理生理

支架植入通過物理學方法對動脈內膜造成功能性和器質性損傷，動脈內膜損傷后通過血管內膜增生、血管重塑、凝血激活和血栓形成等病理生理過程引起ISR［7］。VSMC增殖、從中膜遷移到內膜、細胞外基質形成和外膜瘢痕形成等是ISR形成關鍵環節。支架植入術后數小時內細胞因子、中性粒細胞可聚集產生炎性反應，1周后巨噬細胞活化，7～14 d時在各種因子刺激下，熱休克蛋白、抗凋亡Bcl-2蛋白、膠原特異性分子伴侶蛋白、肌球蛋白重鏈蛋白等表達增加［8-9］。Giacoppo等［10］臨床研究顯示，藥物洗脫支架（drug eluting stent，DES）通過釋放抗增殖藥物明顯降低ISR發生率。支架內新生動脈粥樣硬化（in-stent neoatherosclerosis，ISNA）是導致ISR的另一個因素。ISNA是指在伴或不伴壞死核形成情況下，支架附近新生內膜富含脂質的泡沫細胞聚集。Zou等［11］研究顯示，頸內動脈ISR患者病變血管支架剝除后支架內充滿新生動脈粥樣硬化和內膜組織。此外，研究發現金屬裸支架植入術后ISNA主要發生在支架近端組織，在支架中段及遠端發生率較低［12］。ISR發生機制還可能與支架植入術后持續慢性炎癥及延遲愈合有關。支架植入術后內皮覆蓋不全、EC缺陷導致血液中白細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、血小板等黏附及滲透作用增強，炎性細胞因子和血管活性物質作用加劇了脂質浸潤。其中炎性介質和細胞因子，如白細胞介素-8、基質細胞衍生因子、血管內皮細胞生長因子、腫瘤壞死因子、基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-9等，可作為ISR獨立預測指標［13］。

2 ncRNA與ISR

2.1 miRNA與ISR

miRNA長度為20～25個核苷酸，可通過堿基互補配對方式識別信使RNA（mRNA），不同程度地促使其衰變或抑制其翻譯。支架植入術后，不同細胞類型miRNA有不同程度上調或下調，其在血流中濃度甚至也可反應其水平變化，因此了解miRNA對了解ISR機制及維持血管完整性至關重要。為發現更有效的治療ISR策略，miRNA提供了一個先進知識框架［14］。

miR-21在VSMC和內皮細胞中高表達，可通過調節不同信號轉導通路發揮作用［15］。Huang等［16］研究表明，熊去氧膽酸（UDCA）通過阻斷miR-21/PTEN/AKT/mTOR信號通路抑制VSMC增殖。miR-21還可靶向多個分子，包括骨形態發生蛋白受體（BMPR）-2、含WW域E3泛素蛋白連接酶（WWP）1、特異AT序列結合蛋白（SATB）1，最終導致慢性缺氧，引起血管重塑［17］。miR-126參與ISR過程中炎性反應，靶向血管細胞黏附分子（VCAM）-1，降低白細胞和EC黏附性［18］。miR-221/222通過靶向E26-1間接調節EC中炎性因子表達。miR-221/222在EC中具有相反作用，可能歸因于中間靶基因p27（Kip1）和p57（Kip2）差異表達譜［19］。

還有許多miRNA，如miR-125a［20］、miR-130a［21］、miR-146a［22］和miR-342-5p［23］，通過靶向信號轉導通路調控VSMC功能和表型。miR-21還明確與藥物涂層支架ISR發生密切相關［10］。miRNA可作為生物標志物或治療靶標，在ISR診斷和治療中發揮重要作用。

2.2 lncRNA與ISR

lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的RNA，作為重要的RNA轉錄物，在血管對機械損傷適應中起著重要作用。lncRNA作用機制大致分為兩類，順式作用的lncRNA對同一基因組位點內靶基因或染色質結構進行調控［4］，其機制包括轉錄增強、組蛋白修飾、染色質折疊、剪接修飾和翻譯調節；反式lncRNA離開轉錄位點，通過遠端調控靶點改變細胞機制。

lnc-RNCR3和lncRNA-430945最近被確定為VSMC增殖和遷移調節因子，下肢ASO患者中這兩種lncRNA水平均升高。lncRNA-430945主要通過促進受體酪氨酸激酶樣孤兒受體（ROR）2表達激活RhoA信號通路［24］。lnc-RNCR3作為miR-185-5p競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），促進EC增殖，進而導致Krüppel樣轉錄因子（KLF）2水平升高。然而在VSMC中是否存在類似調控網絡尚待觀察［25］。

lncRNA-00113在下肢ASO患者血清中高表達，沉默lncRNA-00113可抑制VSMC增殖，但促進VSMC和EC遷移。lncRNA-00113被認為是通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路促進EC增殖。但這些發現尚未在VSMC中得到證實。血小板衍生生長因子（PDGF）刺激VSMC后，ceRNA、生長阻滯特異性轉錄因子（GAS）5下調。GAS5過度表達可通過充當miR-21“分子海綿”阻止PDGF-BB誘導的VSMC增殖和遷移［26］。GAS5過度表達的EC釋放胞外體可減少VSMC增殖和遷移，反之亦然，突顯GAS5在VSMC-EC串擾中的重要作用。此外，GAS5通過β-肌動蛋白（actin）在VSMC和EC中的核定位調節β-actin信號通路［27］。這項研究表明lncRNA并非僅具有細胞特異性。這既為多細胞靶向治療ISR提供機會，也增加靶向效應的風險。

2.3 circRNA與ISR

circRNA分子呈封閉環狀結構，不受RNA外切酶影響，表達更穩定，不易降解。circRNA分子富含miRNA結合位點，在細胞中可解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因表達水平。這使circRNA有可能成為ISR臨床診斷和治療新靶點，CZNF609在EC中高表達，下調CZNF609可促進EC遷移并保護EC免受氧化應激損傷。circRNA-心臟相關circRNA（HRCR）通過調控miR-223影響心力衰竭［28］。

2.4 其他ncRNA與ISR

siRNA是20～25個核苷酸長度的雙鏈ncRNA，能與mRNA結合并促使其裂解，以沉默特定mRNA翻譯過程。它可通過多種轉染技術引入細胞和組織影響靶基因［29］。piRNA與Piwi蛋白相互作用，對轉座子進行調控，保護生殖細胞不受轉座元件失調影響。piRNA是一種生殖細胞特有的小ncRNA［30］。這兩種ncRNA在ISR形成中的作用研究仍處于初步階段，機制尚不明確。

ncRNA在ISR中的機制見圖1。

圖1 ncRNA在ISR中的機制

3 ncRNA在ISR臨床的應用

不同支架屬性、支架直徑、支架數量、支架重疊、支架膨脹不全等，均會影響血管壁完整性和血流動力學，進而導致ISR發生。臨床證據表明球囊擴張時間和所施壓力與miR-92a有關［31］。金屬裸支架植入術后ISR發生率為17%～41%，藥物球囊及DES術后ISR發生率＜10%，說明支架不同屬性也對ISR有影響［32］。目前研究顯示臨床應用DES可降低裸金屬支架引起的ISR發生率，但會導致動脈延遲愈合和晚期血栓形成，而基因洗脫支架可克服這些缺點。有文獻報道，可通過多種遞送系統結合納米技術將基因遞送至目標區域持續釋放基因，干擾VSMC、EC生物學功能，從而預防ISR［33］。抗miR-21洗脫支架在動物模型中已證實可減少VSMC增殖，且對EC無不利影響［15］。近年來，ncRNA已整合到微球集成支架、腺病毒或納米顆粒中，準備進入臨床試驗階段。

綜上所述，基因洗脫支架是支架技術的一項重大突破，為解決ISR和晚期血栓形成提供了思路。該支架不僅可攜帶抗炎藥和抗血栓藥，還可攜帶ncRNA，將基因固定在生物材料表面，送達阻塞部位持續釋放，通過影響易感區域中基因表達降低ISR和晚期血栓發生率。但基因洗脫支架仍處于探索階段，明確其發生機制，評估其治療有效性、長期效果等，還需進行更多研究。