腦膠質(zhì)瘤中MMP-9及vimentin蛋白表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性分析

劉翠萍，葛欣，賢俊民，郭西文，梁憲坤，李進(jìn)軍

（菏澤市立醫(yī)院腫瘤科，山東 菏澤 274000）

膠質(zhì)瘤是臨床中常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤，具有較強(qiáng)的侵襲性、致瘤性，且易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，嚴(yán)重威脅患者的生命安全[1]。雖然腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未完全明確，但細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）均為引起腫瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[2-3]。金屬基質(zhì)蛋白酶可通過降解ECM促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周圍的組織侵襲轉(zhuǎn)移[4]。金屬基質(zhì)蛋白酶-9（MMP-9）能對ECM中的IV型、V型膠原進(jìn)行降解，進(jìn)而參與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[5]。有研究[6]指出，波形蛋白（vimentin）對于腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是必不可少的，會影響許多腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，尤其對腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究旨在探究腦膠質(zhì)瘤中MMP-9、vimentin蛋白表達(dá)水平對患者預(yù)后的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取 2017 年 4 月至 2020 年 8 月本院接收的膠質(zhì)瘤患者126例，隨訪脫落6例，實際納入116 例作為觀察組。其中女62 例，男54 例；平均年齡（48.26±4.12）歲；參照kernohan法[7]實施病理分級：Ⅰ級 30 例，Ⅱ級 37 例，Ⅲ級 28 例，Ⅳ級 21 例。另選取同期本院接收的顱腦損傷患者68 例作為對照組。其中女 47 例，男 21 例；平均年齡（49.00±5.00）歲。兩組臨床資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均經(jīng)診斷明確為膠質(zhì)瘤；符合與WHO 有關(guān)的分類標(biāo)準(zhǔn)[8]；均開展顯微手術(shù)切除；患者及家屬均簽署知情同意書；均以頭痛、頭昏、肢體乏力以及嘔吐等顱內(nèi)壓上升表現(xiàn)為主要癥狀，部分患者伴隨視力降低、語言障礙或偏癱。排除標(biāo)準(zhǔn)：接受過化療或放療者；有腦部手術(shù)或腦部嚴(yán)重外傷病史者；精神或認(rèn)知明顯障礙，不具備正常溝通交流能力者。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué) 應(yīng)用10%的甲醛固定腦組織，石蠟包埋后，進(jìn)行切片、脫蠟，并進(jìn)行熱抗原修復(fù)，通過漂洗、孵育后，滴1∶100已稀釋好的MMP-9、vimentin，4 ℃過夜孵育；加二抗，37 ℃孵育30 min；加辣根酶標(biāo)記工作液，37 ℃孵育30 min，出現(xiàn)DAB顯色后，借助蘇木素予復(fù)染、脫水。借助顯微鏡，應(yīng)用Image-ProPlus 6.0 對免疫組化染色切片進(jìn)行檢測、觀察，并評判結(jié)果。無陽性細(xì)胞為“-”；陽性細(xì)胞計數(shù)＜25%，為“+”；陽性細(xì)胞計數(shù)為25%～50%，為“++”；陽性細(xì)胞計數(shù)＞50%，為“+++”。“-”“+”為陰性，“++”“+++”為陽性。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR 利用Trizol法提取腫瘤組織mRNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計靶基因（MMP-9、vimentin）及管家基因（β-actin）的上下游引物，應(yīng)用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒對mRNA 進(jìn)行檢測，各項擴(kuò)增程序：95 ℃變性15 s，62 ℃退火 25s，72 ℃延伸 35s。借助 2-ΔΔCt計算觀察組腦組織中目的基因的mRNA。

1.3.3 隨訪觀察 從患者接受顯微手術(shù)切除治療后開始隨訪，至2020 年8 月21 日截止，借助門診回訪、電話及微信回訪等了解腫瘤是否出現(xiàn)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移及患者的生存率。

1.4 觀察指標(biāo) 比較兩組免疫組化檢查結(jié)果、MMP-9、vimentin mRNA 表達(dá)水平差異及膠質(zhì)瘤患者預(yù)后影響因素。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以“”表示，行t檢驗，計數(shù)資料以[n（%）]表示，行χ2檢驗；采用Logistics多元回歸分析影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的相關(guān)因素，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢查結(jié)果 免疫組化結(jié)果表明，觀察組MMP-9、vimentin 陽性率為65.5%和73.3%，對照組MMP-9、vimentin 陽性率為10.3%、17.6%，兩組MMP-9、vimentin 的表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖1。

表1 兩組腦組織MMP-9、vimentin免疫組化結(jié)果比較Table 1 Comparision of MMP-9 and vimentin immunohistochemistry between two groups

圖1 腦組織中MMP-9、vimentin的免疫組化結(jié)果Figure 1 Immunohistochemical results of MMP-9 and vimentin in brain tissue

2.2 兩組MMP-9、vimentin mRNA 表達(dá)水平差異分析 觀察組腦組織MMP-9 和vimentin mRNA 相對表達(dá)水平顯著高于對照組（t=3.135，P＜0.001；t=2.774，P＜0.001），見圖2。MMP-9和vimentin mRNA相對表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的病例級別相關(guān)，高級別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤MMP-9 和vimentin mRNA 相對表達(dá)水平高于低級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤（P＜0.05），見圖3～4。

圖2 兩組患者腦組織MMP-9和vimentin mRNA相對表達(dá)水平Figure 2 Relative mRNA expression of MMP-9 and vimentin in brain tissue of two groups patients

圖3 不同級別膠質(zhì)瘤患者M(jìn)MP-9 mRNA的相對表達(dá)水平Figure 3 Relative mRNA expression of MMP-9 in different grades gliomas

圖4 不同級別膠質(zhì)瘤患者vimentin mRNA的相對表達(dá)水平Figure 4 Relative mRNA expression of vimentin in different grades gliomas

2.3 膠質(zhì)瘤患者預(yù)后影響因素的Logistics 回歸分析 Logistics 回歸分析結(jié)果表明，MMP-9 和vimentin mRNA 表達(dá)水平均為影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵因素（P＜0.05），見表2。

表2 膠質(zhì)瘤患者預(yù)后影響因素的Logistics 回歸分析Table 2 Logistic regression analysis of prognostic factors in patients with glioma

2.4 MMP-9、vimentin 表達(dá)水平對患者預(yù)后的影響觀察組MMP-9、vimentin 表達(dá)與其生存率存在相關(guān)性，Kaplan-Meier生存分析指出，MMP-9、vimentin的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的累積總生存率密切相關(guān)（P=0.0171、0.0315），當(dāng)MMP-9、vimentin表達(dá)為陰性時，患者的預(yù)后更好，見圖5～6。

圖5 MMP-9對膠質(zhì)瘤患者生存率的影響Figure 5 Effect of MMP-9 on survival of glioma patients

圖6 vimentin對膠質(zhì)瘤患者生存率的影響Figure 6 Effect of vimentin on survival of glioma patients

3 討論

膠質(zhì)瘤是具有較強(qiáng)侵襲性的惡性腫瘤，其高病死率與強(qiáng)侵襲性密切相關(guān)[9]。近年來，有研究[10]對腫瘤所出現(xiàn)的侵襲、轉(zhuǎn)移等有關(guān)機(jī)制進(jìn)行分析與研究，指出ECM、EMT 均與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此，探究ECM相關(guān)蛋白以及EMT相關(guān)蛋白處于強(qiáng)侵襲性惡性腫瘤中總體的表達(dá)，對于癌癥的各項診斷與治療均具有重要意義。

研究表明，MMP 家族蛋白與多種腫瘤的預(yù)后顯著相關(guān)，尤其是對于高級別膠質(zhì)瘤患者，腫瘤組織MMP家族蛋白的高表達(dá)對腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移以及患者的生存期具有重要影響[11-12]。MMP 家族蛋白可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，從而促進(jìn)ECM 相關(guān)生長因子，如 TGF-β 的轉(zhuǎn)移。MMP-9 是一類重要的金屬基質(zhì)蛋白酶，MMP-9 在星形膠質(zhì)細(xì)胞以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長、侵襲中具有關(guān)鍵作用[13]，同時，Tadas等[14]指出，在小鼠和人的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中，MMP-9大多出現(xiàn)在小膠質(zhì)細(xì)胞中，且對TLR2有關(guān)的信號通路激活后，能促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞中MMP-9總體表達(dá)。本研究結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤患者腦組織中的MMP-9 高于正常腦組織。Li等[15]應(yīng)用全基因組分析的方法探究了MMP 家族各個成員，結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤組織中MMP-9、MMP-1均高于正常腦組織，與本研究結(jié)果一致。vimentin是EMT相關(guān)的經(jīng)典標(biāo)志分子，可通過上調(diào)Axl受體酪氨酸激酶促進(jìn)EMT 的進(jìn)程從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[16]。vimentin可通過參與多種信號通路的調(diào)節(jié)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，因此，vimentin很有可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，目前以vimentin 為靶點(diǎn)的相關(guān)藥物如醉茄素A、水飛薊賓等對高表達(dá)vmentin的腫瘤均表現(xiàn)出良好的治療效果。本研究中，膠質(zhì)瘤中vimentin高于正常腦組織，且不同級別的膠質(zhì)瘤患者vimentin表達(dá)不同，表明vimentin不僅可作為膠質(zhì)瘤診斷的相關(guān)指標(biāo)，而且有望成為膠質(zhì)瘤治療的靶點(diǎn)。

此外，本研究結(jié)果也表明，MMP-9 和vimentin的表達(dá)水平均為影響患者預(yù)后的獨(dú)立相關(guān)因素，Kaplan-Meier生存分析結(jié)果也表明，高表達(dá)MMP-9和 vimentin 的膠質(zhì)瘤患者預(yù)后更差，與 Li 等[15，17]研究結(jié)果一致，但Li 等[15]證明了vimentin 表達(dá)偏高會使患者對替莫唑胺產(chǎn)生耐藥性。本研究尚未探討MMP-9和vimentin表達(dá)是否會使患者產(chǎn)生耐藥性，未來將進(jìn)一步闡明MMP-9 和vimentin 表達(dá)是否具有相關(guān)性且是否與患者產(chǎn)生耐藥性相關(guān)。

綜上所述，膠質(zhì)瘤患者M(jìn)MP-9、vimentin 表達(dá)高于對照組，且MMP-9、vimentin 與膠質(zhì)瘤患者的病理級別密切相關(guān)，在具有更高級別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者腦組織中的MMP-9 和vimentin 表達(dá)水平高于低級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤，且MMP-9、vimentin 表達(dá)水平是影響患者預(yù)后的獨(dú)立相關(guān)因素，MMP-9和vimentin低表達(dá)的患者預(yù)后更好，為膠質(zhì)瘤患者的診斷以及預(yù)后預(yù)測提供了的臨床依據(jù)。