基于頂空氣相色譜-離子遷移譜對乳桿菌及產香酵母 發酵紅棗汁的香氣成分分析

王銀,田真,楊晨晨,王賢,曹煒,岳田利

(西北大學 食品科學與工程學院,陜西 西安,710069)

紅棗,具有補中益氣,養血安神等功效,被《中國藥典》收錄為藥食同源食品[1]。我國陜西沿黃流域地區紅棗的栽培面積約17.342萬hm2,年產量達70萬t,是紅棗重要優生區之一[2]。國內紅棗產業存在加工產品附加值低、科技含量相對較低等問題[3-4]。益生菌發酵不僅能除去原果中苦味、澀味等不良風味,還能賦予紅棗更為豐富、濃郁的香味成分,提高其營養價值及產品附加值[5-7]。

頂空氣相色譜-離子遷移譜聯用技術(headspace-gas chromatography-ion migration spectroscopy,HS-GC-IMS)將氣相色譜與離子遷移譜有效結合,克服了GC-MS耗時長、解譜難,電子鼻法精度較低、易漂移,氣相色譜嗅覺測量法(GC-O)穩定性不高等缺點[8-9]。在食品風味分析及香氣指紋圖譜構建中顯示出巨大的發展潛力[10]。

課題組前期從蜂蜜中分離出的2株產香物質豐富的產香酵母菌,具有獨特的應用開發前景。本研究以陜北佳縣紅棗為原料,通過測定產香酵母及乳桿菌發酵后紅棗汁理化指標,結合HS-GC-IMS對揮發性香氣成分進行定性,確定不同菌種發酵紅棗汁香氣指紋圖譜,初步探究益生菌發酵對紅棗汁品質及香氣成分的影響。研究結果可對后續益生菌發酵紅棗汁的工業生產菌種篩選、品質評價提供理論依據,并進一步拓寬HS-GC-IMS技術在紅棗資源開發與利用的應用領域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干紅棗,陜西佳縣；酵母菌(Zygosaccharomycessp.XDJM-1；Zygosaccharomycessp.XDJM-2)為分離自蜂蜜中的產香酵母菌,均為本實驗室保存；保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus,LB),北京川秀科技有限公司；MRS瓊脂、MRS肉湯,北京陸橋；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、鄰苯三酚、重鉻酸鉀、2,6-二氯靛酚,西安三浦化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Flavour Spec?氣相離子遷移譜聯用儀,德國G.S.A公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司；TGL-206R離心機,上海安亭科學儀器廠；DSX-280KB24滅菌鍋,上海申安醫療器械廠；DHP-9162恒溫培養箱,上海齊欣科學儀器有限公司；722型紫外分光光度計,青島聚創環保設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株活化

將凍存酵母菌及乳桿菌分別劃線接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(yeast extract peptone dextrose medium,YPD)及MRS平板上過夜培養,挑取單克隆轉接于YPD及MRS液體培養基中,分別在28、42 ℃下培養36 h。用無菌超純水清洗菌體2次,離心收集菌體,4 ℃貯存備用。

1.3.2 紅棗發酵汁制備

(1)清汁制備：選取無霉爛紅棗,洗凈、蒸煮4 h。紅棗與水質量比1∶3打漿,過濾后加入0.15%的果膠酶進行酶解。離心,取上清液,65 ℃滅菌25 min。

(2)接種發酵：將酵母菌與乳桿菌分別以0.1%及0.5%(質量分數)的比例接種于滅菌紅棗汁中。酵母菌發酵汁、乳桿菌發酵汁及滅菌清汁分別在28、42 ℃下培養4 d,發酵完成后于4 ℃貯存。

1.3.3 理化指標測定

維生素C含量參照GB 5009.86—2016《食品安全國家標準 食品中抗壞血酸的測定》第三法2,6-二氯靛酚滴定法測定；酒精含量采用比色法測定；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性測定采用鄰苯三酚自氧化法；可溶性固形物采用手持折光儀測定。

1.3.4 HS-GC-IMS分析

(1)樣品前處理：取1 mL樣品80 ℃孵化15 min,進樣針85 ℃進樣500 μL。

(2)色譜柱：FC-SE-54；色譜柱溫度40 ℃；載氣：高純N2(純度>99.999%)；設置程序流速2.00 mL/min保持2 min,20 min內線性增至100 mL/min。

(3)IMS條件：漂移管溫度45 ℃；漂移氣：N2(純度>99.999%)；漂移氣流速150 mL/min。

1.3.5 感官評價

感官評價方法參照GB/T 31121—2014《果蔬汁類及其飲料》。將3種紅棗發酵汁(XDJM-1、XDJM-2、LB)與未發酵的紅棗汁(CK)隨機編號,邀請7名受過專業訓練的品評人員,分別從色澤(包括顏色明亮度、澄清度、均勻度)、香氣(包括果香味、酒花香味)、組織形態、口感(包括甜度、酸度、酸甜適宜度、苦度、辛辣度)4個方面進行評價[8]。感官評價以10分為標準,對7位品評者的打分結果進行統計分析。

1.3.6 數據處理

最終數據以(平均值±標準偏差)表示,采用Graph pad prism 8.0軟件進行數據處理及繪圖。

HS-GC-IMS風味成分通過GC-IMS Library search 1.0.3軟件進行分析,并采用LAV中Gallery插件構建指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 理化指標

如表1所示,不同菌種發酵后紅棗汁乙醇含量及SOD酶活性存在顯著差異。雖然乳桿菌發酵紅棗汁的維生素C含量最高(0.73 g/L),但不同組間維生素C含量無顯著差異(表1,圖1-a)。不同菌種發酵紅棗汁乙醇含量、可溶性固形物及SOD酶活性與對照組相比存在顯著差異(P<0.05)(表1)。酵母菌XDJM-1、XDJM-2發酵后乙醇體積分數分別為1.30%及1.47%,極顯著高于乳桿菌發酵組及對照組(圖1-b),而可溶性固形物均低于乳桿菌發酵汁(圖1-d),這是由于發酵產酒精過程消耗其可溶性固形物,與其產酒精能力相對應。經益生菌發酵后,紅棗汁SOD酶活性均顯著提高,其中LB發酵棗汁的SOD酶活性達7.19 U/mL,極顯著高于對照及酵母組(圖1-c)。

表1 不同菌種發酵棗汁的理化指標Table 1 Physical and chemical indexes of jujube juices fermented by different strains

2.2 HS-GC-IMS二維譜圖分析

圖2為不同菌種發酵紅棗汁HS-GC-IMS指紋圖譜,橫坐標為離子遷移時間,縱坐標為氣相色譜保留時間,紅色豎線為反應離子峰(reaction ion peak,RIP),其右側的每一個點代表一種揮發性有機物,顏色隨物質濃度增高而加深,整個譜圖代表了發酵紅棗汁的全部頂空成分。由三維譜圖(圖2-b)及其二維投影譜圖(圖2-a)可以看出紅棗汁經酵母菌發酵后樣品揮發性組分相對豐度明顯高于乳桿菌發酵樣品,且揮發性組分具有較明顯差異。其中圓圈標注位置為乳桿菌發酵樣品LB特有揮發性物質組分,方形標注位置為酵母菌發酵樣品特有揮發性物質組分。

2.3 不同菌種發酵紅棗汁的揮發性組分定性分析

采用HS-GC-IMS內置NIST數據庫進一步定性分析,從XDJM-1、XDJM-2、LB發酵紅棗汁中共識別出39種揮發性成分(表2)。主要為醛酮類及醇類化合物,其中酮類化合物10種,醛類化合物8種,醇類化合物7種,酯類化合物6種,雜環類化合物5種,酸類化合物2種,醚類化合物1種(表2)。乳桿菌發酵紅棗汁香型主要為醛香型,酵母菌發酵后則以酮醇香型為主。研究表明,紅棗汁香氣成分主要以酮類及醛類物質為主,經過發酵后逐漸生成酯類及醇類組分[13]。本研究中紅棗汁均為輕度發酵,因此生成的酯類及醇類物質較少,與上述究結果一致。

a-維生素C含量;b-乙醇含量;c-SOD酶活性;d-可溶性固形物圖1 不同菌株發酵紅棗汁理化指標Fig.1 Physical and chemical indexes of jujube juices fermented by different strains注：****：P<0.000 1；***：P<0.000 2；*：P<0.05

a-HS-GC-IMS 二維譜圖;b-HS-GC-IMS 三維譜圖圖2 不同菌種發酵紅棗汁HS-GC-IMS譜圖Fig.2 HS-GC-IMS spectrum of jujube juices fermented by different strains

構建不同菌種發酵紅棗汁香氣指紋圖譜,比較揮發性組分不同樣品間相對豐度差異(圖3)。醛酮類化合物是紅棗特征香氣物質的主要成分,同時可以使紅棗發酵產品感官香氣更為明顯。乳桿菌發酵紅棗汁中苯甲醛、戊醛、糠醛、3-甲基丁醛相對豐度均顯著高于酵母菌發酵產物(表2,圖3)。其中苯甲醛呈果香味,3-甲基丁醛呈水果香,糠醛屬于芳香族醛,賦予發酵汁焦糖香味及苦杏仁味[11]。乳桿菌發酵紅棗汁醛類化合物顯著高于酵母發酵,可能與紅棗汁中抗壞血酸在微生物作用下降解生成大量的C6～C9小分子醛和糠醛有關。胡貝多等[12]選取6種商業益生菌分別對紅棗汁進行發酵,研究發現發酵紅棗汁的特征風味主要來源于氮氧化物、廣譜甲基類、硫化物、萜烯類、乙醇和芳香化合物,這與本研究結果略有差異,推測與紅棗成熟度、干燥度及產地有關。馬騰臻等[1]以甘肅地區的紅棗為原料釀造紅棗酒,共鑒定出10種醛酮類化合物,與本研究中乳桿菌發酵汁風味結果較為相似。酵母菌發酵紅棗汁中除苯乙酮外,剩余9種酮類化合物相對豐度均遠高于乳桿菌發酵產物。其中2,3-戊二酮、2,3-丁二酮及乙偶姻賦予發酵汁愉快的奶油香味。3-辛酮、2-戊酮具有典型的水果及植物香氣,且為酵母發酵汁中特有的香氣組分[13]。有研究報道酮類化合物為新鮮紅棗汁重要香氣成分[14]。而醛酮類物質屬于不穩定的中間化合物,隨著不同菌種的發酵,其產物變化也相對較大,因此本研究中乳桿菌和酵母菌發酵紅棗汁分別呈現醛香型和酮醇香型。由于本研究中酵母菌及乳桿菌發酵紅棗汁的時間與果酒相比較短,因此對發酵過程中醛酮類物質的代謝及轉化影響相對較少。

酯類物質具有較強的果香及花香的感官性質,對紅棗汁及發酵汁特殊香氣的形成具有非常重要的貢獻[11]。本研究中除乙酸己酯在乳桿菌發酵紅棗汁中相對豐度略高于酵母菌發酵汁外,紅棗汁經酵母菌發酵后酯類物質種類及相對豐度均高于乳桿菌發酵。其中乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯為酵母菌發酵紅棗汁特有組分(表2,圖3)。乙酸乙酯具有類似蘋果、桃等果香及花香味,是紅棗果酒中酯類香氣的重要組分。乙酸己酯及乙酸異戊酯具有強烈的香蕉、梨等甜水果香氣[9],乙酸苯乙酯則賦予紅棗發酵汁濃郁的花香氣。本研究中酵母發酵產生大量醇類物質,脂肪酸、醇經過發酵和陳釀不斷酯化生成酯類物質,而乳桿菌發酵過程中醇類物質較少,其酯類物質種類也較少。因此酵母菌與乳桿菌發酵紅棗汁酯類物質相對豐度及種類具有較大差異,而豐富的酯類物質可賦予紅棗發酵汁令人愉悅的果香及花香氣味[1,15]。其次,不同酵母發酵后其酯類物質種類與相對豐度也略有差異,任曉宇等[11]發現紅棗白蘭地中含量較高的酯類物質為月桂酸乙酯、苯甲酸乙酯、丁酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯,與本研究略有不同,可能與紅棗的原料產地、酵母種類、加工工藝以及發酵液的含糖量有關[16-18]。

發酵過程使紅棗中的氨基酸和糖發生轉化,亞麻酸降解物氧化生成醇類化合物[11]。醇類化合物賦予發酵汁新鮮的醇香風味,同時也是發酵果汁中酯類化合物重要的前體物質[9,12]。紅棗汁經乳桿菌發酵后正丁醇、2-甲基丙醇相對豐度高于酵母菌發酵,其中正丁醇具有水果醇香味,2-甲基丙醇則主要起到呈香呈味作用[16]。酵母菌發酵后醇類物質種類多于乳桿菌發酵,且異戊醇、2-甲基丁醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇均為酵母菌發酵特有產物(表2,圖3)。醇類是發酵過程中酵母代謝形成的重要次級代謝產物,其含量易受發酵條件和酶解條件等因素的影響[19]。有文獻表明果酒的清香氣味主要來自于C6～C9的醛醇類化合物,由脂肪酸經過逐步氧化、裂解及還原形成[3]。異戊醇與2-甲基丁醇均為雜醇油,具有蘋果、白蘭地、辛辣味,是果酒發酵中主要的呈香組分之一[8,16]。3-甲基-3-丁烯-1-醇賦予紅棗發酵汁辛辣味與水果氣味。但只有當高級醇與酸、酯比例協調時才有助于豐富棗酒風味成分[16]。本研究中乳桿菌在紅棗汁發酵過程中對醇類物質生成過程影響較小,而酵母菌通過一系列氧化還原、酯化反應將醛類物質代謝為其他的醇酸酯類物質。

雜環類物質雖然相對豐度較低,但是具有獨特的風味,對紅棗發酵汁特征香氣的形成也有一定的作用[20]。2-乙基呋喃、2,6-二甲基吡嗪及正戊基呋喃是酵母菌發酵汁中特有的雜環類物質,2-乙基呋喃具有甜香、咖啡香和薄荷芳香風味,2,6-二甲基吡嗪呈現咖啡和炒花生的氣味,正戊基呋喃則具有青草香氣。異戊酸、2-甲基丙酸是酵母菌發酵汁中主要的脂肪酸類化合物,具有甜潤的果香、奶酪味及脂肪味,對發酵產物風味呈現正向貢獻。雖然本研究中紅棗發酵汁中酸類物質種類較少,且僅酵母發酵汁中有2種脂肪酸類物質,但發酵飲品中的脂肪酸類物質主要為微生物代謝生成的副產物,對紅棗發酵汁特征風味的形成也有重要影響[5]。

由不同菌種發酵紅棗汁特征風味指紋圖譜可發現(圖3),酵母菌與乳桿菌發酵棗汁的風味物質的種類和相對豐度存在較大差異,且酵母菌發酵后風味組分及豐度均高于乳桿菌發酵。其中A區域為酵母及乳桿菌發酵共有組分,主要為苯乙酮、苯甲酸甲酯、苯乙醛和2-乙酰基呋喃,這部分物質受發酵菌種影響較小,推測為紅棗中原有組分。B區域為乳桿菌發酵優勢組分,主要為醛類物質并賦予乳桿菌發酵汁醛香型特性。C區域為酵母菌發酵優勢組分,主要為酮類物質及雜環類化合物。D區域為酵母菌發酵特有組分,主要為酮類化合物和醇類化合物,共同賦予酵母發酵紅棗汁酮醇香型特性。另一方面,不同酵母菌間風味成分也略有差異,例如XDJM-2發酵后乙偶姻、2-乙酰基呋喃(二聚體)、乙酸苯乙酯、3-辛酮、正戊基呋喃、乙酸異戊酯、異戊酸等呈香性物質相對豐度均略高于XDJM-1發酵紅棗汁。相比于醛類對乳桿菌發酵汁風味物質的重要影響,酯類則在酵母菌發酵汁的特征香氣中占主導作用,并與其他醇酮類物質相互協調,共同賦予酵母菌發酵棗汁獨特的風味和良好的口感。

表2 發酵紅棗汁揮發性風味成分的定性分析Table 2 Volatile compounds identified in fermented jujube juice

圖3 不同菌種發酵紅棗汁的指紋譜圖Fig.3 Fingerprints of jujube juices fermented by different strains

2.4 感官評價

紅棗汁經3種益生菌發酵后整體感官評分均顯著高于對照組,其中酵母菌XDJM-1發酵紅棗汁的總風味評分最高。乳桿菌與酵母菌發酵紅棗汁間各項指標均有一定差異。而2種酵母菌發酵汁除在口感方面具有顯著差異外,在色澤、組織形態、香氣均無顯著差異(圖4-a)。

酵母菌發酵紅棗汁組織形態整體優于乳桿菌發酵汁。2種發酵汁香氣類型具有顯著差異,其中乳桿菌發酵汁果香味較突出,而酵母發酵紅棗汁中酒花香味是表征其總風味的主要香氣,其中,XDJM-1發酵后酒花香味更為濃郁,評分顯著高于XDJM-2(P<0.05)(圖4-b)。紅棗汁經酵母菌發酵后乙醇含量顯著提高,同時HS-GC-IMS中定性出酵母發酵特有的3-甲基丁醇、2-甲基丁醇、乙酸乙酯及乙酸異戊酯等都有助于酒花香味的形成與突出,這與感官評價結果相符。

紅棗汁在不同益生菌發酵后,甜度和苦度均顯著下降,整體口感差別較大。乳桿菌發酵汁酸度顯著高于酵母發酵汁,這與其發酵產酸特性相對應。紅棗汁經酵母菌發酵后其辛辣度顯著提高,一方面由于乙醇含量顯著提高,另一方面推測可能與特有的3-甲基丁醇、2-甲基丁醇等香氣組分特性相關。不同酵母菌在辛辣度、苦度以及酸甜協調度上均存在顯著差異,其中XDJM-1的酸甜協調度評分最高,XDJM-2的苦度、辛辣度評分較高,因此在紅棗發酵后續開發中應注重調節和改善(圖4-c)。

a-綜合評價；b-外觀、香氣評價；c-口感評價圖4 不同菌種發酵紅棗汁感官評價雷達圖Fig.4 Radar map of sensory evaluation of jujube juice fermented by different strains

3 結論

本研究采用蜂蜜中分離的產香酵母及乳桿菌分別對陜北佳縣紅棗汁進行發酵。其中,產香酵母發酵對紅棗汁乙醇含量影響顯著,最高達1.62%,發酵后酒花香突出,酸甜協調度最優；乳桿菌發酵對紅棗汁SOD活性影響顯著,最高為7.19 U/mL,發酵后果香突出,酸度較高。發酵后總風味、口感、香氣、組織形態及色澤均顯著提高。通過HS-GC-IMS在發酵紅棗汁中共定性出39種風味物質,主要為醛酮類、醇類及酯類。酵母菌發酵后香氣物質種類及相對豐度明顯高于乳桿菌發酵,其中異戊醇、2-甲基丁醇、2-乙基呋喃、2-戊酮、乙酸乙酯、乙酸異戊酯是酵母菌區分于乳桿菌發酵產品的主要香氣物質。研究結果顯示,前期研究從蜂蜜中分離的產香酵母具有較好的產香特征,乳桿菌則會提高紅棗發酵汁生物活性。該研究為進一步拓寬HS-GC-IMS應用范圍,及后續蜂蜜產香酵母在益生菌發酵紅棗汁中產業化應用、工藝開發提供了理論依據。