高通量測(cè)序分析羊肚菌—赤松茸輪作土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化

鄧瑩蓮，趙長(zhǎng)林

（西南林業(yè)大學(xué) 生物多樣性保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650224）

0 引言

羊肚菌（Morchellaspp.）是在全球廣泛分布的一類珍貴食（藥）用真菌，隸屬子囊菌門(mén)Ascomycota、盤(pán)菌綱（Pezizomycetes）、盤(pán)菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（Morchella），具有重要的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，羊肚菌具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗疲勞、抑制腫瘤、抗菌、抗病毒、降血脂、抗氧化等多種生物活性［2］。近年來(lái)，我國(guó)羊肚菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，栽培規(guī)模擴(kuò)大，助力羊肚菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展已成為地方政府年度規(guī)劃和當(dāng)?shù)剞r(nóng)民重要的經(jīng)濟(jì)來(lái)源和特色產(chǎn)業(yè)。但羊肚菌栽培過(guò)程中連作障礙“卡脖子”問(wèn)題已成為不可逾越的鴻溝，導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)大幅下降，這一短板嚴(yán)重制約了羊肚菌產(chǎn)業(yè)的綠色健康、可持續(xù)發(fā)展。

作物連作障礙產(chǎn)生機(jī)理十分復(fù)雜，是系統(tǒng)內(nèi)諸多因素綜合作用的結(jié)果［3］。隨著科學(xué)研究的縱向延伸，研究成果推測(cè)作物—微生物—土壤系統(tǒng)的平衡關(guān)系失調(diào)是引起連作障礙的主要因素［4］。連作障礙問(wèn)題已成為嚴(yán)重制約農(nóng)林業(yè)健康發(fā)展的首要問(wèn)題?；诤侠淼妮喿鳎欣诰S持土壤微生物的生態(tài)平衡，助力土壤微生物活性增強(qiáng)，有效改善土壤質(zhì)量，從而緩解連作障礙［5］。此外，研究表明，羊肚菌與番茄［6］、吊瓜［7］、辣椒和長(zhǎng)裙竹蓀［8］等輪作，不僅提高了土地資源的利用率，還提升了羊肚菌的產(chǎn)量和品質(zhì)，同時(shí)在一定程度上改善了羊肚菌的連作障礙。

食用菌具有腐生特性，對(duì)土壤中礦物質(zhì)轉(zhuǎn)化、高分子降解及活性物質(zhì)的富集均有較好的促進(jìn)作用［9］。赤松茸也是一種在國(guó)內(nèi)被廣泛推廣栽培的珍稀食（藥）用菌，學(xué)名大球蓋菇(Stropharia rugosoannulataFarl. ex Murrill)，又名皺環(huán)球蓋菇、皺球蓋菇、酒紅球蓋菇、裴氏球蓋菇、大紅菇等，隸屬于擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、傘菌綱(Agaricomycetes)、傘菌目(Agaricales)、球蓋菇科(Strophariaceae)、球蓋菇屬［Stropharia(Fr.) Quél.］［10］。其栽培技術(shù)成熟，栽培原料來(lái)源豐富，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、抗雜菌、抗逆能力強(qiáng)［11］。種植赤松茸能夠改善土壤理化性質(zhì)及提高微生物群落豐度［12］。研究揭示赤松茸與水稻、玉米、柑橘、草莓等［13-14］輪作，可明顯改善土壤質(zhì)量，增加土壤酶活性，提高作物產(chǎn)量，有效緩解草莓連作障礙。

赤松茸和羊肚菌深受廣大人民群眾喜愛(ài)，其市場(chǎng)前景廣闊，其中羊肚菌在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上備受歡迎，近年來(lái)出口量持續(xù)走高，長(zhǎng)期以來(lái)一直處于洛陽(yáng)紙貴、供不應(yīng)求的狀態(tài)。土壤微生物在生物地化循環(huán)中扮演著重要角色，推動(dòng)著土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)換和能量流動(dòng)［15］。近年來(lái)有關(guān)羊肚菌—赤松茸輪作方式對(duì)羊肚菌土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究鮮有報(bào)道，因此，關(guān)于赤松茸—羊肚菌輪作栽培能否緩解羊肚菌連作障礙，其輪作前后土壤微生物時(shí)空變化機(jī)制等還有待進(jìn)一步研究。本研究根據(jù)羊肚菌栽培時(shí)間 (11—12月種植，種植周期約為5個(gè)月)與赤松茸栽培時(shí)間 (6月上旬栽植，種植周期4～5個(gè)月)上的延續(xù)吻合性，選取云南省大理州劍川縣六妹羊肚菌和赤松茸輪作栽培為試驗(yàn)樣地，采用高通量測(cè)序平臺(tái)Illumina Novaseq分析羊肚菌—赤松茸栽培后，土壤微生物群落中細(xì)菌和真菌的變化趨勢(shì)，進(jìn)而解析并探討羊肚菌—赤松茸輪作模式是否能夠緩解羊肚菌的連作障礙的科學(xué)問(wèn)題，旨在為羊肚菌合理復(fù)種、緩解連作障礙提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)信息

試驗(yàn)采樣地位于云南省大理州劍川縣彌沙鄉(xiāng)六妹羊肚菌栽培基地 (海拔2656.3 m，99°63′61.57″E，26°34′37.20″N)。羊肚菌栽培1年后，同年6月在同一塊地上栽培赤松茸，待羊肚菌和赤松茸采收結(jié)束后，分批次進(jìn)行采樣，采樣過(guò)程中土樣設(shè)置3個(gè)重復(fù)，使用50 mL康寧離心管 (已滅菌)進(jìn)行分裝，確保土樣完整、無(wú)污染。取樣完成后低溫保藏，每個(gè)樣本置于-80 ℃冰箱中保存。本次采集土樣分別為羊肚菌原壤（ydj0：zcl051、zcl052、zcl053）、羊肚菌1年壤（ydj1：zcl055、zcl056、zcl057）和赤松茸1年壤（csr1：zcl088、zcl089、zcl090）。

1.2 土壤微生物高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析

委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司利用Illumina Novaseq平臺(tái)進(jìn)行土壤樣品高通量測(cè)序。采用DNA提取試劑盒提取和純化，使用特異引物515F（5′-CCTAYGGRBGCASCAG-3′）和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）對(duì)土壤細(xì)菌16S rRNA基因的16S V4變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增真菌通用引物序ITS5-1737F和ITS2-2043R(ITS5-1737F: 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，ITS2-2043R: 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠回收，用Qia-gen Gel Extraction Kit (Qiagen, Ger-many) 進(jìn)行純化，采用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparat-ion Kit試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，經(jīng)過(guò)Qubit@ 2.0熒光計(jì) (Thermo Scient-ific)和Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估，文庫(kù)合格后，在Illumina NovaSeq平臺(tái)上對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，并生成250 bp雙末端讀數(shù)。

使用FLASH （Version 1.2.7）軟件對(duì)樣本Reads進(jìn)行拼接，過(guò)濾處理，參照Qiime （Version 1.9.1）軟件進(jìn)行質(zhì)控處理，使用UCHIME算法檢測(cè)并去除嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)。將序列在97% 相似度下，利用Uparse （Version 7.0.1001）軟件對(duì)所有樣本序列進(jìn)行聚類成為OTUs。用Mothur（Version 1.30.2）與SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1.0），統(tǒng)計(jì)各個(gè)分類水平各樣本的群落組成。對(duì)各樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理后，使用Qiime （Version 1.9.1）軟件計(jì)算α多樣性指數(shù) （Shannon、Simpson、Chao1、ACE、goods_coverage、PD_whole_tree），使用R （Version 2.15.3）軟件繪制稀釋曲線和進(jìn)行α多樣性指數(shù)組間差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌—赤松茸土壤細(xì)菌和真菌OTU聚類分析

稀釋性曲線 (Rarefaction Curve)旨在從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量序列，用于驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中物種多樣性，并間接反映樣品中物種豐富程度。由圖1可知，在各樣品所含有效序列數(shù)范圍內(nèi)，隨樣品測(cè)序條數(shù)的增加，曲線趨于平緩，說(shuō)明樣品序列充分，此環(huán)境中物種并不會(huì)隨測(cè)序數(shù)量的增加而顯著增多，可進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過(guò)統(tǒng)計(jì)各階段序列數(shù)、序列長(zhǎng)度等參數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)開(kāi)展評(píng)估。本試驗(yàn)共涵蓋9個(gè)土壤樣本，測(cè)序后共獲得細(xì)菌739289對(duì)原始序列 (Raw reads)，經(jīng)質(zhì)控、拼接后共產(chǎn)生671886條高質(zhì)量序列 (Clean Reads)，每個(gè)樣品至少產(chǎn)生63726條Clean Reads，平均產(chǎn)生74654條Clean Reads，平均長(zhǎng)度為253 bp。分析共獲得真菌728065對(duì)Raw Reads，雙端Reads質(zhì)控、拼接后共產(chǎn)生658169條Clean Reads，每個(gè)樣品至少 產(chǎn) 生54299條Clean Reads，平 均 產(chǎn) 生73130條Clean Reads。

圖1 樣品稀釋曲線

對(duì)所有處理在97%序列相似度下得到的土壤細(xì)菌OTU數(shù)目進(jìn)行聚類統(tǒng)計(jì)，繪制韋恩（Venn）圖用以直觀呈現(xiàn)不同處理共有特征和特有特征的數(shù)目（圖2），從而結(jié)合特征所代表物種，找出不同環(huán)境中特有微生物。所測(cè)得的細(xì)菌共有27門(mén)、60綱、170目、312科、603屬和683種，其中真菌共有23門(mén)、61綱、123目、176科、197屬和206種。由圖2可知，羊肚菌原壤、羊肚菌1年壤和赤松茸1年壤3種土樣共同擁有細(xì)菌OTU數(shù)目為1760個(gè)、真菌OTU數(shù)目為177個(gè)，3種土樣特有細(xì)菌OTU數(shù)目分別為7、28和88個(gè)，特有真菌OTU數(shù)目分別為55、51和236個(gè)，ydj0和ydj1共有111個(gè)細(xì)菌OTU、104個(gè)真菌OTU，僅有46個(gè)細(xì)菌OTU和31個(gè)真菌OTU同時(shí)分布于csr1和ydj1中，csr1與ydj0共有細(xì)菌OTU數(shù)目和真菌OTU數(shù)目分別為31和42個(gè)。

圖2 韋恩圖

2.2 羊肚菌—赤松茸土壤細(xì)菌和真菌多樣性分析

基于土壤樣品中細(xì)菌群落α多樣性分析指數(shù)，對(duì)羊肚菌、赤松茸栽培土壤細(xì)菌群落物種豐富度和均勻度進(jìn)行評(píng)估 (cutoff=57363)。結(jié)果揭示：不同處理土壤的細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)覆蓋率分別達(dá)到99.6%以上和100.0%（表1），說(shuō)明土壤樣本測(cè)序數(shù)據(jù)足夠真實(shí)，可反映其細(xì)菌和真菌群落的多樣性。由表1可知，代表土壤細(xì)菌群落豐富度的ACE指數(shù)與Chao1指數(shù)和代表多樣性的Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)均無(wú)顯著差異，ACE指數(shù)與Chao1指數(shù)隨著羊肚菌和赤松茸的更替栽培均呈下降趨勢(shì)，但Simpson指數(shù)分析顯示，ydj1細(xì)菌群落多樣性最低，csr1最高，而Shannon指數(shù)分析顯示ydj0、ydj1和csr1的Shannon指數(shù)差異較明顯，ydj0中土壤細(xì)菌群落內(nèi)物種分布多樣性最高， csr1次之， ydj1中最低。表征真菌群落多樣性的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)以及表征豐富度的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均存在明顯差異。與ydj0相比較，ydj1和csr1的α多樣性各指數(shù)大都在升高，且csr1各指數(shù)大都高于ydj1，表明赤松茸栽培可提高羊肚菌土壤中細(xì)菌和真菌群落內(nèi)物種的多樣性，同時(shí)通過(guò)栽培赤松茸可提高羊肚菌土壤中真菌群落內(nèi)的物種豐富度。

表1 樣本真菌和細(xì)菌α多樣性指數(shù)

非度量多維尺度NMDS (Non-Metric Multi-Dimensional Scaling)散射圖估算的真菌和細(xì)菌群落β多樣性顯示，群落分布分為csr1、ydj0和ydj1 3個(gè)不同的組 (圖3)，圖中點(diǎn)分別表示各樣品，不同顏色代表不同分組，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離表示差異程度，真菌和細(xì)菌的NMDS分析圖顯示兩者的stress分別為0.0180和0.0254，均小于0.2，表明NMDS分析具有一定的可靠性，且ydj0和ydj1組真菌、細(xì)菌群落相似性較高，csr1與其他2組的差異性較大。

圖3 NMDS分析

2.3 羊肚菌—赤松茸土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

過(guò)濾低豐度特征 (物種豐度＜0.005%)，獲取門(mén)水平各樣品中相對(duì)豐度較大的10個(gè)細(xì)菌門(mén)類群(圖4)。ydj0、ydj1和csr1這3組土樣中相對(duì)豐度存在差異，其中Proteobacteria和Bacteroidota隨著羊肚菌和赤松茸的栽培呈上升趨勢(shì)，且Proteobacteria為3組土壤細(xì)菌的主要優(yōu)勢(shì)類群，Bacteroidota在3種土樣中相對(duì)豐度存在顯著差異；Chloroflexi和Myxococcota隨著羊肚菌—赤松茸的栽培呈下降趨勢(shì)，且csr1中Myxococcota相對(duì)豐度顯著降低；ydj1較ydj0的Acidobacteriota顯著減少，但通過(guò)栽培赤松茸后顯著增加；Actinobacteriota在羊肚菌栽培后呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，但栽培赤松茸后顯著降低。而Gemmatimonadota和Verrucomicrobiota變化與Actinobacteriota趨勢(shì)相反；與對(duì)照組ydj0相比，F(xiàn)irmicutes呈上升趨勢(shì)，但與ydj1相比，栽培赤松茸后該細(xì)菌類群減少。研究揭示栽培赤松茸可有效調(diào)節(jié)羊肚菌栽培后土壤內(nèi)細(xì)菌菌群。

圖4 門(mén)水平上3組土樣細(xì)菌分布情況

科、屬水平分析表明：在相對(duì)豐度較大的科和屬中（圖5），栽培赤松茸后土壤細(xì)菌群落Gemmatimonadaceae的Gemmatimonas和Pseudomonadaceae的Pseudomonas顯著下降，Gemmatimonadaceae在ydj0、ydj1和csr1這3種土壤中為細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌科，優(yōu)勢(shì)屬細(xì)菌分別為Pseudomonas(5.93%)、Sphingomonas(6.20%)和隸屬于Gemmatimonadaceae的未知屬(6.75%)；Xanthobacteraceae (5.91%)、Nitrosomonadaceae (3.38%)和Micrococcaceae (3.59%)相對(duì)豐度在ydj1中占比最高，但經(jīng)過(guò)栽培赤松茸后明顯減少；Chitinophagaceae和Comamonadaceae相對(duì)豐度隨著羊肚菌和赤松茸的輪作栽培呈上升趨勢(shì)，且Chitinophagaceae顯著增加。

圖5 科 (屬)水平上各樣本細(xì)菌分布情況

使用R軟件，選取土壤真菌菌群豐度排名前100的屬，根據(jù)其在各個(gè)土壤處理中的豐度信息，從真菌菌群種類、土壤類型2個(gè)層面進(jìn)行聚類，根據(jù)聚類結(jié)果繪制成Heatmap熱圖（圖6）。通過(guò)聚類能夠區(qū)分高豐度和低豐度的分類單元，紅色和藍(lán)色代表菌屬的豐度，越偏向紅色表明豐度越高，越偏向藍(lán)色表明豐度越低。如圖6所示對(duì)不同土樣細(xì)菌在屬種水平上進(jìn)行分析，根據(jù)進(jìn)化關(guān)系，細(xì)菌群落OTU在縱向上可以聚類為兩大類，根據(jù)豐度變化顯示，Arenimonas、Bacteroides、Bacillus、Pseudolabrys、Nitrospira、Bryobacter、Burkholderia_Caballeronia_Paraburkholderia、Chryseolinea、Chthoniobacter、Comamonas、Devosia、Ellin6067、mle1_7、Pandoraea和Rubrobacter等在csr1中豐度最高，且csr1中Candidatus_Solibacter和Candidatus_Udaeobacter豐度與ydj0的相近，Bradyrhizobium細(xì)菌群落豐度在csr1中顯著降低。

圖6 樣品細(xì)菌屬水平聚類熱圖

2.4 羊肚菌—赤松茸土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

原始特征表常涵蓋極低豐度特征 (物種豐度＜0.005%)，過(guò)濾低豐度特征后，旨在獲取各樣品中相對(duì)豐度較大的真菌類群，研究分析了樣本真菌群落在門(mén)和屬水平上的豐度變化情況 (圖7)?；诓煌瑯悠分袃?yōu)勢(shì)真菌門(mén)的分析表明： ydj0、ydj1和csr1優(yōu)勢(shì)門(mén)均為Ascomycota，Mucoromycota真菌在csr1中豐度最高，Basidiomycota在ydj0中豐度最高；ydj0和ydj1 優(yōu)勢(shì)屬真菌為T(mén)ausonia，而csr1優(yōu)勢(shì)屬真菌為Mucoromycota。

圖7 門(mén) (屬)水平上各樣本真菌分布情況

使用R軟件，選取土壤真菌菌群豐度排名前100的屬，根據(jù)其在各個(gè)土壤處理中的豐度信息，從真菌菌群種類、土壤類型2個(gè)層面進(jìn)行聚類，根據(jù)聚類結(jié)果繪制成Heatmap熱圖。通過(guò)聚類能夠區(qū)分高豐度和低豐度的分類單元，紅色、藍(lán)色代表菌屬的豐度，越偏向紅色表明豐度越高，越偏向藍(lán)色表明豐度越低。如圖8所示對(duì)不同土樣細(xì)菌在屬種水平上進(jìn)行分析，根據(jù)進(jìn)化關(guān)系，細(xì)菌群落OTU在縱向上可以聚類為兩大類，根據(jù)真菌豐度變化趨勢(shì)，ydj0和ydj1這2組樣本聚為一支，表明這2組細(xì)菌群落組成相似度較高；csr1與ydj0、ydj1這2組樣本細(xì)菌群落組成差異性較大，且差異性較大的真菌群落有Phymatotrichopsis、Sphaerode、Mortierella、Geminibasidium、Olpidium、Chaetomium、Thelebolus、Sistotrema和Spizellomyces。值得關(guān)注的是，F(xiàn)usarium在ydj0組中豐度最高，在csr1組中豐度最低。

圖8 樣品真菌屬水平聚類熱圖

本試驗(yàn)土樣中Basidiomycota、Fusarium和Tausonia，Hypocreales、Pleosporales和Leotiomycetes內(nèi)的一些真菌類群在栽培赤松茸后出現(xiàn)不同程度地減少，而Chaetomium、Mortierella和unclassified_Sordariales的一些真菌屬在栽培赤松茸后出現(xiàn)了不同程度的增加，栽培赤松茸后土壤中Ascomycota和Mucoromycota真菌相對(duì)豐度變化趨勢(shì)與羊肚菌栽培后截然相反；其中Chaetomiaceae內(nèi)真菌在羊肚菌栽培后大幅增加，但在栽培赤松茸后土壤中該類群真菌大幅度降低。

3 結(jié)論與討論

土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是土壤生態(tài)環(huán)境質(zhì)量的重要組成部分，且扮演著不可替代的作用［16］；本研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析表明，輪作對(duì)土壤微生物群落種類組成影響較小，但在群落相對(duì)豐度上存在顯著差異。王瑾［17］研究揭示，Chitinophagaceae與硝化作用呈正相關(guān)，Comamonadaceae參與有機(jī)碳的降解，Bacteroidetes參與有機(jī)氮的礦化；本研究 中Chitinophagaceae、Comamonadaceae和Bacteroidota的相對(duì)豐度隨著羊肚菌—赤松茸的輪作栽培呈上升趨勢(shì)，且Bacteroidota和Chitinophagaceae的相對(duì)豐度顯著增加，說(shuō)明輪作赤松茸有助于增加羊肚菌土壤中的有益微生物。徐新雯等［18］研究表明，輪作大蒜可以提高煙根際有益細(xì)菌Gemmatimonadetes的數(shù)量和多樣性，而本研究中栽培羊肚菌后土壤中該類菌群減少，輪作赤松茸后該類菌群出現(xiàn)增加趨勢(shì)，與上述研究結(jié)果一致。殷繼忠等［16］基于分析連作對(duì)大豆根際土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響表明，大豆連作后土壤中Sphingomonas的相對(duì)豐度均大于輪作土樣，本研究中Sphingomonas在ydj1的豐度占比顯著增加，通過(guò)輪作赤松茸可顯著降低該菌群的豐度，從而維持土壤細(xì)菌群落的平衡。納小凡等［19］基于研究連作對(duì)再植枸杞根際細(xì)菌群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響，表明了枸杞根際連作后Verrucomicrobiota的相對(duì)豐度明顯降低；本研究中ydj1樣品中該菌群最低，輪作赤松茸后土壤中該類菌群出現(xiàn)增加趨勢(shì)，間接證明輪作可維持土壤中該菌群的平衡。輪作赤松茸后土壤中大多數(shù)細(xì)菌類群與栽培羊肚菌后變化趨勢(shì)相反，該結(jié)果表明輪作赤松茸能夠干擾羊肚菌與土壤微生物間的互相作用，可有效調(diào)節(jié)羊肚菌根際土壤益生菌和致病菌群間的平衡關(guān)系。

肖禮［20］研究認(rèn)為，土壤微生物中大部分真菌類群參與了土壤有機(jī)質(zhì)礦化的分解，促進(jìn)了土壤養(yǎng)分的更新和再利用，并提高了土壤有效養(yǎng)分的含量。Phong等［21］研究表明，真菌Chaetomium類群為常見(jiàn)的生防菌，可有效降解纖維素和有機(jī)物，并對(duì)土壤中其他微生物產(chǎn)生拮抗作用；本研究數(shù)據(jù)揭示真菌Chaetomium類群在赤松茸栽培后顯著增加，可能是赤松茸土壤中大多數(shù)真菌相對(duì)豐度減少的原因之一。鐘壹鳴等［22］通過(guò)檳榔間作香露兜發(fā)現(xiàn)，自養(yǎng)型有益細(xì)菌Chloroflexi的相對(duì)豐度與全磷呈極顯著負(fù)相關(guān)，而羊肚菌栽培后土壤磷含量顯著上升［23］，本研究中栽培羊肚菌后Chloroflexi呈下降趨勢(shì)，這可能是由土壤磷含量顯著上升導(dǎo)致；Tan等［24］研 究 表 明，Chloroflexi的 豐 度 與 羊肚菌產(chǎn)量呈正相關(guān)，推測(cè)該類群微生物與羊肚菌連作障礙呈負(fù)相關(guān)。本研究數(shù)據(jù)顯示：栽培赤松茸后Mucoromycota和Sordariales有增加趨勢(shì)，而Sordariomycetes中Paecilomyces penicillatus和Diploospora longispora是阻礙羊肚菌的生產(chǎn)和質(zhì)量以及引起羊肚菌白霉?。?5］和霉菌性枯萎?。?6］的主要病原菌，因此赤松茸輪作后，在羊肚菌栽培過(guò)程中需及時(shí)防范該類病害的發(fā)生。

敖金成等［27］研究表明，土壤真菌、細(xì)菌、放線菌、固氮、解磷等功能菌數(shù)量與土壤肥力高低呈正相關(guān)；徐繼偉等［23］通過(guò)研究羊肚菌栽培的經(jīng)濟(jì)效益及對(duì)土壤的影響，發(fā)現(xiàn)羊肚菌栽培前后棚內(nèi)外土壤磷含量顯著上升，而微球菌Micrococcaceae為解磷作用的微生物［28］，本研究中Micrococcaceae相對(duì)豐度在ydj1中占比最高，推測(cè)該類菌群與羊肚菌栽培后磷元素含量的上升有直接關(guān)系。土壤結(jié)構(gòu)的良好維持和物質(zhì)養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，離不開(kāi)土壤中較高的微生物群落多樣性［29］，Tan等［30］研究揭示，羊肚菌產(chǎn)量與土壤真菌和細(xì)菌群落多樣性呈正相關(guān)，且在羊肚菌高產(chǎn)量土壤中發(fā)現(xiàn)了一些參與固氮和硝化的細(xì)菌微生物，如Arthrobacter、Bradyhizobium、Devosia、Pseudarthrobacter、Pseudolabrys、Nitrospira和Candidatus_Solibacter等［31］；Fan等［32］研究證實(shí)，Candidatus_Solibacter和Brad-yrhizobium的生物多樣性決定了作物的產(chǎn)量，與作物產(chǎn)量呈正相關(guān)，并與大部分參與養(yǎng)分循環(huán)的功能基因豐度呈正相關(guān)。本試驗(yàn)中栽培赤松茸后Candidatus_Solibacter、Devosia、Pseudolabrys等微生物顯著增加，且表征微生物群落多樣性的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在csr1組中均高于ydj1組；該結(jié)果表明：輪作赤松茸有利于提高土壤肥力的同時(shí)也有助于羊肚菌產(chǎn)量的提高。

研究發(fā)現(xiàn)菇—菜—辣椒［33］和西瓜—草菇—辣椒［34］輪作能明顯改善土壤根際環(huán)境，提高土壤有機(jī)質(zhì)的含量，增加土壤中細(xì)菌的數(shù)量，降低有害病原真菌的數(shù)量，恢復(fù)土壤微生物種群數(shù)量，對(duì)辣椒連作障礙有明顯緩解作用。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)從土壤微生態(tài)菌群變化視角進(jìn)行分析，結(jié)果表明：輪作赤松茸可提高羊肚菌土壤中微生物群落物種多樣性，有助于增加土壤有益細(xì)菌類群和降低病原真菌類群，同時(shí)在一定程度上能夠有效調(diào)節(jié)羊肚菌土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)的平衡關(guān)系，與上述研究結(jié)果一致，這為進(jìn)一步解析羊肚菌連作障礙“卡脖子”問(wèn)題提供了微生物學(xué)視角的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。但該研究?jī)H從細(xì)菌、真菌群落組成及相對(duì)豐度的角度分析了羊肚菌—赤松茸輪作土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，這些微生物豐度變化所導(dǎo)致的生態(tài)功能不同及對(duì)羊肚菌和赤松茸產(chǎn)量的影響仍需從不同角度進(jìn)行深入剖析。