OPN、Pyk2、p-AKT在舌鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

劉 霞，李 強，陳 勇，趙淑娟，郭榮珍，史炳霞，陳巧力，南桂英，孟召霞，張 冉，張 靜

舌癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤，有80%屬于鱗狀細胞癌，以舌前2/3部位常見；20%為腺癌，多位于舌根部。舌癌的轉移與浸潤是一個復雜的過程，可受多種基因調控[1]。有研究顯示，在腫瘤細胞發生、發展過程中，細胞外基質發揮著重要的作用，骨橋蛋白(OPN)則是細胞外基質中的一種非膠原蛋白，能參與細胞免疫、信號傳導、骨礦化、細胞黏附等過程[2]。富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)則是黏著斑激酶中的一員，可改變多種含SH2結構域的底物蛋白，使其磷酸化，對骨架重組、細胞黏附、離子通道激活等多種信號傳導通路具有調節作用，可調控細胞活性、增殖及遷移能力，在腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用[3]。磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(p-AKT)屬于高度保守的蛋白激酶，能夠調控細胞的增殖與分化[4]。OPN、Pyk2、p-AKT在多種惡性腫瘤的發生、發展過程中均發揮著重要的作用。基于此，本文分析OPN、Pyk2、p-AKT在舌鱗狀細胞癌中的表達情況，分析三者與舌鱗狀細胞癌患者臨床病理特征之間的關系，以期為臨床診療和預后評估提供新的參考標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年2月—2020年2月滄州市中心醫院診治103例舌鱗狀細胞癌組織(舌癌組)及距腫瘤邊緣>0.5 cm的癌旁正常組織(對照組)，其中男69例，女34例；年齡45～79(60.11±2.34)歲；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期58例，Ⅲ～Ⅳ期45例；病理分化程度：低-中分化41例，高分化62例；有淋巴結轉移49例，無淋巴結轉移54例。治療方式：根治性手術66例，根治性手術+周圍淋巴結清掃37例；術后放化療：是69例，否34例。①納入標準：均經術后病理檢查證實為舌鱗狀細胞癌；無其他惡性腫瘤；臨床資料完整；患者及家屬均簽署知情同意書。②排除標準：存在血液系統或免疫系統疾病者；合并心、肝、腎等嚴重原發性疾病者；入組前行放化療者。本研究經醫院醫學倫理委員會批準執行。

1.2方法

1.2.1OPN、Pyk2、p-AKT檢測方法：OPN、Pyk2、p-AKT均應用免疫組織化學法檢測，兔抗人OPN多克隆抗體和DAB顯色劑試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)、兔抗人Pyk2單克隆抗體(美國vitrogen公司)、兔抗人p-AKT多克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)。①操作步驟：將組織石蠟切片脫蠟、水化后行枸櫞酸溶液微波修復，使用3%過氧化氫溶液在室溫封閉內源性過氧化物10 min，3%小牛血清蛋白、37 ℃封閉1 h。滴加OPN、Pyk2、p-AKT一抗，4 ℃過夜，PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性標本作為陽性對照。滴加辣根過氧化物酶標記的二抗IgG-HRP，在37 ℃封閉30 min，DAB使用重氮氨基苯顯色2～5 min，以蘇木素進行輕度襯染，隨后進行水洗、脫水、使用中性樹膠進行封片，以光學顯微鏡觀察。②結果判讀：Pyk2、p-AKT蛋白著色為粗細不均勻的棕黃色顆粒，定位于細胞質或細胞核內，記為Pyk2、p-AKT表達陽性。細胞質中出現明顯的棕黃色顆粒記為OPN表達陽性。在高倍鏡(×400)視野計數100個細胞中陽性表達細胞數，總共計數5個視野，取平均值。使用半定量積分法對結果進行判讀：0分為無陽性細胞；1分為陽性細胞數≤25%；2分為陽性細胞數25%～50%，3分為陽性細胞數50%～75%，4分為陽性細胞數>75%。以細胞著色程度進行評分：細胞無著色記0分；細胞著色為淡黃色記1分；細胞著色為棕黃色記2分；細胞著色為棕褐色記3分。根據兩項得分之和計算結果，得分<3分為陰性，≥3分則為陽性，得分越高，陽性表達越高。

1.2.2隨訪：在術后隨訪13個月了解患者預后情況，根據生存情況分為生存組和死亡組。

1.3觀察指標 比較不同組織中OPN、Pyk2、p-AKT表達情況，分析OPN、Pyk2、p-AKT與舌鱗狀細胞癌患者臨床病理參數的關系，并分析影響舌鱗狀細胞癌患者預后生存的危險因素。

2 結果

2.1不同組織中OPN、Pyk2、p-AKT表達情況 舌癌組OPN、Pyk2、p-AKT表達陽性率均明顯高于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 舌鱗狀細胞癌和癌旁正常組織兩組OPN、Pyk2、p-AKT表達情況[例(%)]

2.2OPN、Pyk2、p-AKT與舌鱗狀細胞癌患者臨床病理參數的關系 不同性別、年齡、腫瘤直徑舌鱗狀細胞癌患者OPN、Pyk2、p-AKT表達情況比較差異無統計學意義(P>0.05)。Ⅲ～Ⅳ期、高分化、有淋巴結轉移舌鱗狀細胞癌患者OPN、Pyk2、p-AKT表達陽性率分別高于Ⅰ～Ⅱ期、低-中分化、無淋巴結轉移患者(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 OPN、Pyk2、p-AKT與舌鱗狀細胞癌患者臨床病理參數的關系(例)

2.3單因素分析 隨訪13個月后，103例中生存81例(78.64%)，死亡22例(21.36%)。Ⅲ～Ⅳ期、高分化、有淋巴結轉移及OPN、Pyk2、p-AKT表達陽性舌鱗狀細胞癌患者病死率分別高于Ⅰ～Ⅱ期、低-中分化、無淋巴結轉移及OPN、Pyk2、p-AKT表達陰性患者(P<0.05，P<0.01)。不同性別、年齡、腫瘤直徑舌鱗狀細胞癌患者的病死率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 影響舌鱗狀細胞癌患者預后生存的單因素分析(例)

2.4多因素Logistic回歸分析 將上述單因素分析中差異有統計學意義的影響因素納入多因素Logistic回歸分析，影響因素賦值：臨床分期(Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1)、病理分化程度(低-中分化=0，高分化=1)、淋巴結轉移(否=0，是=1)、OPN表達(陰性=0，陽性=1)、Pyk2表達(陰性=0，陽性=1)、p-AKT表達(陰性=0，陽性=1)。Ⅲ～Ⅳ期、高分化、有淋巴結轉移以及OPN、Pyk2、p-AKT表達陽性是影響舌鱗狀細胞癌患者預后生存的獨立危險因素(P<0.01)。見表4。

表4 影響舌鱗狀細胞癌患者預后生存的多因素Logistic回歸分析

3 討論

OPN是與惡性轉化有關的磷酸化蛋白提取物，是骨骼、牙齒礦化細胞外基質的主要成分[5]。近年來有研究表明，在許多腫瘤中可發現OPN表達明顯上調，而且OPN表達與腫瘤生物學行為及預后存在著密切的聯系[6]。有研究顯示，在大腸癌、胃癌、卵巢癌、食管癌等癌細胞中均發現OPN表達明顯上調，且OPN表達與患者病理學分期存在一定的聯系[7-8]。也有學者發現，OPN在乳腺癌中表達明顯升高，而且OPN表達陽性患者的預后生存時間明顯短于OPN表達陰性患者，提示OPN表達與患者預后存在顯著相關性[9-10]。國外研究也發現，在多種上皮性惡性腫瘤組織中OPN表達明顯高于周圍正常組織，在患者外周血液中的含量也明顯升高，可為腫瘤診斷與篩查提供參考[11]。本研究結果顯示，舌鱗狀細胞癌組織中OPN表達陽性率明顯高于癌旁正常組織，其表達與臨床分期、病理分化程度、淋巴結轉移情況密切相關，說明OPN在舌癌發生、發展及淋巴結轉移過程中發揮著重要作用。

Pyk2參與腫瘤細胞遷移、凋亡，在腫瘤發生、發展過程中的作用也逐漸凸顯[12-13]。本研究發現，Pyk2主要表達于細胞質，在癌組織中陽性率高于癌旁正常組織。其他研究也發現，Pyk2在頭頸部鱗癌、前列腺癌、非小細胞肺癌中表達也明顯增加[14-15]。進一步研究發現，Pyk2表達與臨床分期、病理分化程度、淋巴結轉移情況顯著相關，說明Pyk2可能參與了舌鱗狀細胞癌的浸潤和轉移，與以往研究結果相符[16]。

AKT作為高度保守的蛋白激酶，在生理情況下處于低活性或失活狀態，如受到某些因素刺激，可導致AKT磷酸化而被激活[17]。p-AKT對細胞增殖、分化等具有重要的調控作用，在口腔癌、直腸癌、食管癌等惡性腫瘤中呈高表達，且可衡量磷脂酰肌醇-3-激酶活性[18-19]。本研究發現，p-AKT表達在癌組織中明顯升高，且隨著惡性程度升高，其陽性程度越高，還與癌組織轉移有關，與以往研究結果一致[20-21]，提示p-AKT參與舌鱗狀細胞癌的發生與發展。另外本研究還發現，OPN、Pyk2、p-AKT表達陽性均為影響舌鱗狀細胞癌患者預后生存的獨立危險因素，三者表達陽性程度越高，患者病死率越高，提示OPN、Pyk2、p-AKT可能是反映舌鱗狀細胞癌生物學行為和預后的重要標志物。如針對OPN、Pyk2、p-AKT作為靶點進行藥物研發，或許可提高舌鱗狀細胞癌患者的綜合治療效果[22]。

綜上所述，OPN、Pyk2、p-AKT在舌鱗狀細胞癌組織中表達均明顯上調，在疾病的發生、發展過程中發揮著重要作用，且與癌細胞浸潤、轉移密切相關，還可為舌鱗狀細胞癌預后評估提供參考。