芬太尼對結直腸癌小鼠瘤體大小及血管內皮生長因子-A、缺氧誘導因子-1α的影響

吳 昱，張占峰，郝書航，汪國基，底 妍，湯龍信

結直腸癌是全球發病率第三、病死率第四的惡性腫瘤，全球每年新發病例達1200萬，死亡60萬，是目前威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，近年來結直腸癌患者逐漸呈現年輕化趨勢，手術是其重要的治療手段[1-4]。阿片類藥物是常用的麻醉用藥，可以通過作用于免疫細胞、腫瘤細胞上的μ和Toll樣受體發揮作用[5]。芬太尼是一種常用的阿片類藥物，能夠與屬于G蛋白偶聯受體的μ受體結合，使其活化[6-7]，關閉電壓門控鈣離子通道，持續抑制腺苷酸環化酶從而減少cAMP的生成[8]，通過抑制MAPK信號通路來控制包括結直腸癌在內的多種腫瘤的轉移和復發[9-11]。缺氧誘導因子-1(HIF-1)和血管內皮生長因子(VEGF)能促進新生血管的生長，進而為腫瘤的生長和復發提供血液和營養支持[12]。同時，VEGF還能夠促進血管通透性和纖維蛋白原外滲，給新生的腫瘤組織和血管提供良好的生長條件[13]。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β亞基組成，其中HIF-1α是功能性亞基決定著HIF-1的轉錄活性，HIF-1α可以提供能量，促進腫瘤組織的生長和遷移[14]。VEGF-A是最主要的VEGF。本研究通過探討芬太尼對結直腸癌小鼠瘤體大小以及VEGF-A和HIF-1α轉錄活性的影響，分析以芬太尼為代表的阿片類藥物對腫瘤生長的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 6～8周齡SPF級雄性BALB/C小鼠購自河北醫科大學動物實驗中心(動物合格證號：冀醫動管字703058號)；枸櫞酸芬太尼注射液購自宜昌人福藥業有限責任公司(批號：81D10011)；VEGF-A(E-MSEL-M0005)、HIF-1α(E-EL-M0687c)試劑盒購自Elabscience公司；逆轉錄試劑盒購自日本TAKARA公司；VEGF-A(ab46154)和HIF-1α(H1alpha67)抗體購自美國Abcam公司。

1.2動物模型的建立及分組 小鼠結腸癌細胞株CT26(河北醫科大學饋贈)在37 ℃、5% CO2條件下，使用含10%滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基進行培養。待細胞培養到對數生長期后，用0.25%胰酶消化，待其成為單細胞懸液后，使用10%胎牛血清中和殘余胰酶，然后離心，觀察細胞生長情況并收集細胞制備單細胞懸液備用。選取15只6～8周齡SPF級雄性BALB/C小鼠在室溫下飼養1周，在每只小鼠右前肢腋窩中部皮下注射CT26細胞1×106個，然后繼續常規飼養。待腫瘤直徑>1 cm后，按照隨機數字表法將15只小鼠隨機分為A、B、C組，每組5只。B組和C組分別給予枸櫞酸芬太尼注射液10和50 μg/(kg·d)腹腔注射，A組給予等量生理鹽水腹腔注射；連續給藥1周后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，收集小鼠心臟血液，同時分離小鼠的瘤體組織，觀察瘤體大小并用標尺測量記錄。

1.3觀察指標及方法

1.3.1血清VEGF-A和HIF-1α水平：處死小鼠后獲取血液，然后離心取上層血清，參照VEGF-A和HIF-1α試劑盒說明書，采用酶聯免疫吸附試驗檢測各組血清VEGF-A和HIF-1α水平。

1.3.2瘤體組織VEGF-A和HIF-1α mRNA表達：應用RT-PCR法檢測瘤體組織VEGF-A和HIF-1α mRNA的表達水平，以B2M為內參基因。VEGF-A[15]上游引物：5'-TCACCCCACTAATGGCACC-3'，下游引物：5'-TCCACTTCCCACCAACAGAC-3'，長度為312 bp。HIF-1α[16]上游引物：5'-TCAAAGTCGGACAGCCTCA-3'，下游引物：5'-CCCRGCAGTAGGTTTCTGCT-3'，長度為90 bp。B2M[17]上游引物：5'-CGGCCTGTATGCTATCCAGA-3'，下游引物：5'-GGGTGAATTCAGTGTGAGCC-3'。取各組瘤體組織1 g剪碎，置于2 ml離心管，加入Trizol裂解液500 μl后置于冰上，使用電動勻漿器勻漿至無肉眼可見團塊。將100 μl氯仿加入含瘤體組織勻漿液的離心管中，充分混勻后于冰上靜置15 min，在4 ℃條件下，以12 000 r/min離心10 min。吸取上層的澄清透明液體200 μl置于新的1.5 ml離心管中，并加入異丙醇200 μl震蕩混勻后在冰上靜置15 min，在4 ℃條件下，以12 000 r/min離心10 min，棄上清，并加入75%乙醇500 μl，洗滌提取的mRNA。在4 ℃條件下，以12 000 r/min離心10 min，后加入200 μl DEPC水，混勻后得到總mRNA。使用逆轉錄試劑盒(日本TAKARA公司)將mRNA逆轉錄為cDNA，根據其說明書配置10 μl反應體系，設置反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ forever，得到cDNA。根據RT-PCR試劑盒說明書配置反應體系后進行RT-PCR反應，用于PCR擴增。設置反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環。以B2M為內參照，記錄Ct值，應用2-ΔΔCt法對各目標基因mRNA的表達進行定量分析。

1.3.3瘤體組織VEGF-A和HIF-1α蛋白表達：采用Western blot法檢測瘤體組織VEGF-A和HIF-1α蛋白表達水平。取各組瘤體組織1 g，按300∶1的比例加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑，裂解組織并提取瘤體組織的總蛋白，用BCA定量的方法測定蛋白含量并計算，使每個樣本中總蛋白含量相同。然后加入蛋白上樣緩沖液混勻后水浴變性10 min。配置并使用10%的SDS-PAGE凝膠電泳，于60 V電壓下電泳90 min后轉至PVDF膜80 min，用5%的脫脂奶粉封閉1 h，分別加入VEGF-A和HIF-1α一抗常溫孵育2 h后，在4 ℃條件下過夜。用TBST清洗后加入二抗常溫孵育2 h。最后，通過增強化學發光試劑盒(Pierce, Rockford, IL, USA)進行顯影。使用Image J 1.47v(Rawak Software, Inc. Germany)軟件分析目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1腫瘤直徑和體積比較 B組和C組腫瘤直徑和體積均明顯小于A組，差異有統計學意義(P<0.05)，但B組與C組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同劑量芬太尼處理結直腸癌小鼠3組腫瘤直徑和體積比較

2.2血清VEGF-A和HIF-1α水平比較 B組和C組血清VEGF-A和HIF-1α水平均明顯低于A組，差異有統計學意義(P<0.05)，但B組與C組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同劑量芬太尼處理結直腸癌小鼠3組血清VEGF-A和HIF-1α水平比較

2.3瘤體組織VEGF-A和HIF-1α mRNA表達情況比較 B組和C組瘤體組織VEGF-A和HIF-1 α mRNA表達水平均明顯低于A組，差異有統計學意義(P<0.05)，但B組與C組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同劑量芬太尼處理結直腸癌小鼠3組瘤體組織VEGF-A和HIF-1α mRNA表達情況比較

2.4瘤體組織VEGF-A和HIF-1α蛋白表達情況比較 B組和C組瘤體組織VEGF-A和HIF-1α蛋白表達水平均明顯低于A組，差異有統計學意義(P<0.05)。C組瘤體組織VEGF-A蛋白表達水平低于B組，差異有統計學意義(P<0.05)；但C組HIF-1α蛋白表達水平與B組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4和圖1。

表4 不同劑量芬太尼處理結直腸癌小鼠3組瘤體組織VEGF-A和HIF-1α蛋白表達情況比較

圖1 不同劑量芬太尼處理結直腸癌小鼠3組瘤體組織VEGF-A和HIF-1α蛋白表達情況

3 討論

本研究采用間斷腹腔注射芬太尼的方法，觀察不同劑量芬太尼對結直腸癌模型小鼠瘤體大小及VEGF-A、HIF-1α的影響，更為接近晚期結直腸癌患者的臨床情況，有比較好的臨床參考價值。

小鼠結腸癌細胞株CT26常用于建立小鼠結直腸癌的動物腫瘤模型[18]。在臨床實踐中，芬太尼的常用劑量是2～8 μg/(kg·d)，小鼠的用藥量為人類的25～50倍[19]，故本研究用藥劑量為10和50 μg/(kg·d)。HIF-1α、VEGF-A能夠促進腫瘤組織內血管的新生，從而促進腫瘤的生長和轉移。有研究顯示，當沉默HIF-1α后，直腸癌SW480細胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯減弱[20]。HIF-1α過度表達后結腸癌HCTT116細胞的遷移和侵襲能力明顯增強，而敲減HIF-1α后觀察到HCTT116細胞的遷移和侵襲能力明顯減弱[21]。同時有研究發現，結直腸癌組織中VEGF表達明顯增高，VEGF的高表達與腫瘤分化程度、腫瘤大小和Duke分期有關，可作為預測結直腸癌患者預后的潛在分子標志物[22]。

阿片類藥物可以通過阿片受體活化和Toll樣受體4通路激活MAPK(ERK 1/2)信號通路，Toll樣受體4通路已經被證實具有抗腫瘤轉移的作用[23]。有研究表明，嗎啡的代謝物3-葡萄糖醛酸嗎啡能激活Toll樣受體4，因此阿片類藥物被證明具有抗腫瘤生長特性[24]。阿片類藥物可以通過c-Jun N末端激酶(JNK)來激活MAPK/ERK/JNK信號通路，抑制PI3K/Akt信號通路從而下調HIF-1α[25]。VEGF能夠通過激活RhoA/Rho，促進腫瘤細胞的遷移，而阿片類藥物通過作用于MAPK/ERK/JNK信號通路，從而抑制RhoA/Rho，降低腫瘤細胞的遷移能力[26-27]。另外，嗎啡也能抑制VEGF的合成[28]。有研究發現，芬太尼也可以通過調控MAPK和PI3K/Akt信號通路抑制基質金屬蛋白酶-9表達，從而抑制胃癌的進展[29]。

本研究結果顯示，10或50 μg/(kg·d)芬太尼均能夠明顯抑制結直腸癌小鼠腫瘤的生長，降低血清VEGF-A、HIF-1α水平以及瘤體組織VEGF-A、HIF-1α mRNA和蛋白表達水平，且50 μg/(kg·d)芬太尼對瘤體組織VEGF-A蛋白表達的抑制作用更好，但是對于其他檢測指標未發現10 μg/(kg·d)與50 μg/(kg·d)芬太尼比較具有差異。本文推測芬太尼可能是通過VEGF-A和HIF-1α抑制瘤體內新生血管的生成，從而間接抑制腫瘤的生長，而這種抑制作用可能與芬太尼劑量相關。

本研究還存在一些不足，如芬太尼對VEGF-A和HIF-1α上下游相關通路的作用沒有進行驗證，未用阿片受體的特異性拮抗劑來進行反向驗證，也未使用VEGF-A和HIF-1α基因敲除鼠進行對照，故還需要更多的證據來證明芬太尼與VEGF-A和HIF-1α之間的作用機制。

綜上所述，芬太尼能夠抑制結直腸癌小鼠腫瘤的生長，這種抑制作用可能是通過下調VEGF-A和HIF-1 α實現的，而且該作用可能與芬太尼的劑量相關。