TGF-β1通過JAK2/STAT3信號對胃癌細胞侵襲和轉移的影響*

王卉卉 張煒宇 李愛英 劉穎

(1.南京市江寧醫院腫瘤內科,江蘇 南京 211100；2.東南大學附屬中大醫院普外科,江蘇 南京 210009)

胃癌作為一種早期癥狀不明確的惡性腫瘤，患者在治療后還會有復發和轉移的風險，也是造成死亡的主要因素，大多數情況下都是在50～60歲之間發生[1-2]。胃癌患者患病初期不具有明顯癥狀，病情處于潛伏期時，患者為對身體的微小反應未重視，以至于失去診斷的最佳時期，發現時通常已經處于發展狀態，開始向周圍組織轉移[3]。胃癌臨床治療基于外科，通過化學療法、放射療法、生物學療法等綜合治療來進行輔助，但效果不理想易復發[4]。近幾年研究表明，作為調節細胞增殖及分化的重要因素，胃癌的浸潤及轉移受到TGF-β1的表達的間接影響。TGF-β1參與了許多生理學和病理學過程，可引起細胞外矩陣和基底膜的分解，從而促進癌細胞的轉移和遷徙能力[5-6]。JAK2/STAT3信號傳輸路徑與血液腫瘤、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的病因有關，JAK2/STAT3信號傳遞路徑異常活躍，抑制這一通路將成為腫瘤治療的新目標[7-8]。STAT3在惡性腫瘤中主要表現為持續的酪氨酸氧化狀態，下游靶基因失調由STAT3過度活化造成，引起不被控制的細胞增殖，阻礙腫瘤細胞的凋亡[9]。癌細胞增值腫瘤微血管生成，參與腫瘤的免疫回避，并抑制免疫功能，致使癌細胞侵襲、轉移致其他臟器。本研究探討TGF-β1通過JAK2/STAT3信號對胃癌細胞侵襲和轉移的影響，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 Trizol試劑(浙江AMEKO)，逆轉錄試劑盒(武漢賽維爾)，RT-PCR試劑盒、流式細胞(上海優予，BCA蛋白濃度測定試劑盒、RPMI-1640培養基(上海一研)。

1.2 細胞處理及分組 準備含10%牛胎血清的RPMI-1640培養基，向培養基中加入處理后的BGC-823細胞和1%氰基鏈霉素，2～3 d的傳代培養，在37℃,CO25%的條件下培養，細胞生長至80%～90%，離心5 min，調整細胞濃度1×104/ mL，24 h后按1∶5接種到培養瓶。棄去培養基，加入由10%FBS/F12配制成的0 μg/L(0 μg/L組)、1.0 μg/L(1.0 μg/L組)、10 μg/L(10 μg/L組)、50 μg/L(50 μg/L組)四種濃度的 TGF-β1反應12 h。

1.3 細胞形態學觀察 選擇不同濃度TGF-β1處理后的BGC-823細胞，做成細胞涂抹標本，二甲苯脫蠟時間15 min，用乙醇駝色，用蘇木素-伊紅(HE)染色，染色后乙醇脫水，每張涂片隨機選擇視野，置于顯微鏡(400×)下觀察BGC-823細胞形態。

1.4 RT-PCR法檢測細胞中JAK2/STAT3的表達 Trizol法提取經過處理的BGC-823細胞的總RNA，將提取出的總RNA 反轉錄成 cDNA，此過程遵照說明書進行，用DNA熒光染料SYBR GreenⅠ對JAK2/STAT3表達水平進行檢測，內參為β-actin。在60℃環境下10 min、95℃ 和720℃環境下各 30 s、95℃環境下5 min，循環次數以40為準，實驗次數至少3次，取基因相對表達量進行分析，引物序列,見表1。

表1 PCR引物序列

1.5 Westernblot檢測細胞中JAK2/STAT3蛋白 裂解經過處理的BGC-823細胞，提取組織中的總蛋白質濃度，用100 V SDS-PAGE電泳總蛋白質，用Bradford法定量蛋白質樣本，轉印到PVDF膜上，10%山羊血清封閉0.5 h。4℃一抗過夜孵育，二抗室溫孵育1 h，室溫洗膜3次，GAPDH做內參，用Quantity one 4.0軟件分析JAK2/STAT3蛋白表達。

1.6 流式細胞術檢測BGC-823調亡情況 將TGF-β1梳理后的BGC-823細胞置入孔板中進行培養，濃度為2×106細胞/ mL，培養時間為24 h，培養完成后采用0.25%胰蛋白酶進行消化，再用70%乙醇固定，4℃環境下靜置1 d，離心5 min，棄去上清液，用PBS洗滌5 min,重復三次，室溫37℃，避開光照進行染色，時長30 min,用流式細胞儀分析細胞凋亡程度。

1.7 細胞克隆測定BGC-823細胞存活率 不同濃度TGF-β1處理的細胞種植到含 10 mL 培養液的培養皿中，37℃環境下培養，孵育 14 d 細胞克隆成功，用 4% 多聚甲醛固定細胞15 min，加入結晶紫染色液，染色時長 20 min，計數細胞克隆數，對各組細胞存活率進行計算。[克隆形成率(%)=(形成的細胞克隆數/接種細胞數)×100%]

2 結果

2.1 HE染色 0 μg/L組中，細胞核呈橢圓形，形狀規則，且細胞排列松散，隨著TGF-β1濃度增加，細胞開始逐漸增多，細胞多為圓形，多個細胞聚集，出現巨核細胞或多核細胞，50 μg/L組與其他組相比細胞數量最多(P<0.05)，見圖1。

圖1 HE染色結果

2.2 BGC-823細胞中JAK2與STAT3的表達情況 RT-PCR法用于檢測經0、1.0 、10、50 μg/L的TGF-β1處理后細胞中JAK2與STAT3的表達水平，發現0 μg/L組JAK2、STAT3表達最低，隨著TGF-β1的濃度增加JAK2、STAT3表達也增加，JAK2依次為0.618±0.114、0.637±0.177、0.919±0.351、1.268±0.278，STAT3依次為0.624±0.121、0.647±0.162、0.981±0.174、1.297±0.264(均P<0.05)，見圖2。

圖2 各組細胞胃癌JAK2與STAT3mRNA的表達情況

2.3 JAK2與STAT3蛋白表達 0 μg/L組JAK2與STAT3蛋白表達最低(P<0.05)，50 μg/L組JAK2與STAT3蛋白表達最高(P<0.05)，隨著TGF-β1濃度增加JAK2與STAT3蛋白也明顯上升，蛋白表達與濃度成正比(均P<0.05)，見圖3。

圖3 各組細胞胃癌JAK2與STAT3蛋白的表達情況

2.4 BGC-823細胞凋亡變化 流式細胞術檢測發現經不同濃度TGF-β1處理后，0μg/L組細胞凋亡最多，50μg/L組細胞凋亡最少，隨濃度增加依次減少，凋亡率分別為2.48±0.21、2.31±0.19±0.11、0.818±0.08(均P<0.05)，見圖4。

圖4 BGC-823細胞凋亡變化

2.5 細胞克隆測定細胞BGC-823細胞的克隆能力 細胞克隆實驗檢測發現在0 μg/L組BGC-823的單克隆群數最少(P<0.05)，而50 μg/L組細胞單克隆群數顯著增加(P<0.05)，隨著TGF-β1濃度增加BGC-823單克隆形成率有上升趨勢(均P<0.05)，見圖5。

圖5 BGC-823細胞的克隆能力

3 討論

胃癌是常見的臨床消化系統腫瘤，近年來發病率有所下降，但發病率和死亡率依然占世界全身性惡性腫瘤的8%和10%[1]。胃癌的早期診斷能減緩病情進展，加之有效的治療方法也是改善患者預后的重要手段，據統計，早期胃癌如果能得到針對性治療，可將患者5年生存率提升至90%或以上[11]。但即使是發達國家，被確診的患者50%以上都進入了疾病發展期，手術完全消除病變和轉移的可能性在50%以下[12]。胃癌的病因是相當復雜的病理學過程，包括多個基因和分子信號傳輸路徑，與胃癌有關的許多因子被發現了，但對胃癌的目標療法起決定性的作用并不多[13]。根據病因和目標療法的研究基礎。JAK2/STAT3信號通路和TGF -β1以及一些炎癥關聯因子慢慢地被用于胃癌的治療[14]。

通過觀察HE染色、細胞凋亡變化、克隆能力發現0 μg/L組細胞核呈橢圓形，形狀較規則，細胞排列松散，隨著TGF-β1濃度增加，細胞開始逐漸增多，呈圓形型排列緊密，多個細胞聚集，有巨核細胞或多核細胞出現，50 μg/L組與其他組相比細胞數量最多。流式細胞術檢測發現經不同濃度TGF-β1處理后，0 μg/L組細胞凋亡最多，50 μg/L組細胞凋亡最少，隨濃度增加依次減少，細胞克隆實驗檢測發現在0 μg/L組BGC-823的單克隆群數最少，而50 μg/L組細胞單克隆群數顯著增加，隨著TGF-β1濃度增加BGC-823單克隆形成率有上升趨勢。研究顯示，TGF -β1是具有25 kd分子量的二本鏈多肽，可促進細胞增殖，調節細胞分化，并且促進細胞外矩陣合成的作用[15]。有研究表明，TGF -β1在很多的腫瘤中出現過表達，并且在腫瘤細胞的EMT進行的誘導中發揮重要的作用，TGF-β1活性得到抑制可使腫瘤體積減少[16]。有研究顯示，TGF-β1及其關聯TGF-β信號傳輸路徑，在胰臟癌等其他惡性腫瘤的發張過程中也有TGF-β1參與[17]，國內外的多的研究顯示，TGF-β1/ 2可作為惡性腫瘤的預后指標使用[18]。相關研究顯示，TGF-β1的負調節可以對向腫瘤關聯成纖維細胞的分化產生抑制作用，并且可以阻礙腫瘤增生的微小環境的形成[19]，這與本文研究相符。

通過檢測JAK2/STAT3表達情況和蛋白變化發現，RT-PCR法用于檢測經0、1.0、10、50 μg/L的TGF-β1處理后細胞中JAK2與STAT3的表達水平，發現0 μg/L組JAK2、STAT3表達最低，隨著TGF-β1的濃度增加JAK2、STAT3表達也增加。Westernblot檢測結果顯示0 μg/L組JAK2與STAT3蛋白表達最低，50 μg/L組JAK2與STAT3蛋白表達最高，隨著TGF-β1濃度增加JAK2與STAT3蛋白也明顯上升，蛋白表達與濃度成正比。有研究證實，STAT3蛋白是一種異常活躍的轉錄因子[20]，通過與JAK2激酶反應增加活性使自己磷酸化，特定靶基因因受到磷酸化的STAT3影響，開始轉錄功能，并誘導相關蛋白，影響細胞增殖、分化和凋亡[21-22]。有研究顯示，JAK2 / STAT3是VEGF基因的直接轉錄活性化因子，根據p53的作用機制調節HIF-1活性[23]。有研究顯示，JAK2/STAT3可以促進腫瘤細胞VEGF的形成，促進血管新生血管內皮細胞游走和細胞管結構的形成。

4 結論

本研究結果顯示，TGF-β1通過活化JAK2/STAT3信號傳輸路徑，可增強胃癌細胞的浸潤和轉移。