大腦類器官在膠質瘤治療中的應用研究及展望

郝路 王之敏

摘要：膠質瘤是一種常見原發性神經系統腫瘤，具有高度異質性和很強的侵襲性，臨床治療存在很大挑戰。當以往研究多以二維細胞培養和動物模型為研究對象，但存在很大缺陷。近年來，科學研究人員構建出一種與人體組織和器官的結構相似的三維結構，類器官，包胞分布和組織、生理結構、電活動和神經元網絡，可模擬出腫瘤微環境，與實體腫瘤具有極高的形式度，有望成為膠質瘤研究的重要平臺。本文對大腦類器官及其構建方法進行了簡要介紹，并對其在膠質瘤研究中的應用進行了歸納。

關鍵詞：膠質瘤、大腦類器官、藥物篩選、個性化治療、腫瘤微環境

【中圖分類號】R73 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2022）02-03

膠質瘤是較為常見的原發性腦腫瘤，其預后較差[1]。目前主要的治療方法是手術切除及放化療，但效果有限，因其在腦組織中生長迅速，對化療有耐藥性，并且具有高度的侵襲性，為臨床治療造成了極大困擾，且膠質瘤容易復發。因此，迫切需要一個研究膠質瘤細胞動力學的平臺，以發現疾病的特點，開發更有效的治療方法。雖然以往研究中的2D細胞模型和動物模型為我們的研究提供了很大的幫助，但它們也存在一定缺陷：缺少腫瘤微環境[2-3];長期培養遺傳特征發生變異[4-6]，周期長、成本高等。近年來，科學研究人員構建出一種與人體組織和器官的結構相似的三維結構，類器官，可以概括人類器官一些關鍵特征，包括細胞分布和組織、生理結構、電活動和神經元網絡[7]，這一模型的出現彌補了二維細胞培養及動物模型之間的缺陷，為研究腫瘤的發生發展提供了獨特視角[8]。

當前的研究中，膠質瘤大腦類器官的形成主要有3種形式：（1）基因編輯大腦類器官誘導腦腫瘤形成，已有研究[9]表明可通過基因編輯技術，使抑癌基因功能喪失，在大腦類器官中誘導腫瘤的發生。（2）膠質瘤干細胞與大腦類器官共培養，患者來源的膠質瘤干細胞是腫瘤在體內生成、增殖和侵襲不可缺少的關鍵性因素[10-11]。（3）從膠質瘤組織或膠質瘤干細胞中獲得膠質瘤類器官，這種保留了母體腫瘤的異質性、相對的三維空間組織。這些方法產生的腦類器官已成為探索膠質瘤發病機制的獨特模式，為膠質瘤的相關研究提供了良好的平臺[12]。

應用于藥物篩選

膠質瘤診斷后生存期較短，急需建立有效的疾病模型和藥物篩選平臺。常規的細胞平臺是2D模式，不能形成正常組織以及腫瘤組織所處的微環境，無法模擬細胞間的相互作用，因此大腦類器官有望成為極具價值的藥物篩選工具[13-14]。動物模型方面，建立人小鼠膠質瘤移植模型耗時較長，且費用昂貴，一些人類治療靶點與小鼠存在一定差異，因此，動物模型評價膠質瘤藥物敏感性的實用性往往較低。膠質瘤誘導的膠質瘤類器官，特別是患者源性細胞產生的類器官，很好地克服了上述兩大問題，為藥物篩選提供了有效的平臺。稱為藥篩平臺主要得以于膠質瘤類器官具有三大突出優勢：（1）首先是其快速生成性，在患者確診后可在短時間內為臨床治療前提供檢測藥物反應;（2）對于培養的單一膠質瘤類器官中，更能表現出膠質瘤的異質性，往往比傳統的膠質瘤模型更能表現出真實的藥物反應;（3）具有更多的分子機制，包括基因表達類型、轉錄方式、不同活躍度的信號通路[15];（4）膠質瘤類器官具有多樣性，并容易擴展，可為膠質瘤表型、基因型及細胞狀態對藥物反應的研究提供基礎[16]。Amanda[17]等使用患者來源的膠質瘤干細胞（GSCs）和人類胚胎干細胞（hESC）構建大腦類器官，這一模型形成迅速，并由腫瘤微管網絡相支持，有助于侵襲正常宿主組織;并用化療藥物和輻射對該模型進行處理，結果發現細胞活力顯著下降，與2D細胞模型相比，其藥物和輻射誘導所致的基因毒性應激具有更高的抵抗性，更能貼近體內檢測結果，表明大腦類器官膠質瘤在體外藥物篩選預測方面具有更高的潛能。Zhang等 [18]于2020年，報道了一個基于膠質瘤患者來源的組織和細胞的實時集成系統，通過生成三維體外大腦類器官和體內異種移植腫瘤，該系統有效地反應除了腫瘤的組織學特征，對化療藥物的反應，以及相應的母體腫瘤的臨床進展;并運用該模型成功地識別了一例II級星形細胞瘤患者，在類器官和異種移植模型中均具有典型的IV級膠質瘤特征，模擬了該患者的疾病進展，我們開發了一個完整的平行模型系統，從患者來源的膠質瘤大腦類器官和異種移植來理解膠質瘤生物學和預測化療藥物的反應，為膠質瘤的治療提供新的思路。

用于個性化治療

膠質瘤大腦類器官還可用于患者的個性化治療。因為隨著用于的基因組測序技術的發展以及在科研、臨床診斷中的應用，使得來源于患者的器官樣培養物可進行實時基因測序，以揭示細胞對不同藥物的反應[19]，因此有助于為患者提供針對性更強的個性化治療方案。

Loong [20]等于2020年將靶向測序技術及患者源類器官培養技術相結合，為患者提供一套個性化治療，為膠質瘤傳統治療方式提供了新的方向。膠質瘤干細胞從第一次手術患者的術中組織中提取，培養出膠質瘤類器官，然后對患者的器官進行靶向捕獲測序技術，為后續的候選藥物提供準確的信息。通過基因測序作者發現：在所有樣本中均有兩個NF1的移碼突變，還有一份高度一致的拷貝數改變。在初級腫瘤中，雜合子PTEN拷貝丟失以及PTENW?III+ 無義突變，提示PTEN功能雙等位基因缺失，可能誘導mTOR信號通路。同時，在最初的臨床表現中PIK3CAH1047Q突變的頻率相對較低，但在復發時其突變頻率變高，這表明了腫瘤自身的異質性。遺傳異常表明了PI3K/ AKT/mTOR通路的激活。接下來，作者在培養的病人源性器官上測試了一組基因組介導的候選藥物，以預測藥物敏感性：作者發現病人的TMZ耐藥性在膠質瘤大腦類器官中再次顯示，因此他們對FDA批準的相關抗癌藥物，如PTEN損失/PTENW?III+藥物mTOR抑制劑依維莫司和NF1移碼突變的絲裂原活化蛋白激酶（MEK）抑制劑考比替尼。與其他藥物相比，膠質瘤類器官對依維莫司的細胞毒性敏感性更高，因此選擇依維莫司作為候選藥物。患者最初每天服用依維莫司5mg，后來逐漸增加到每天10mg。治療四周后復查影像學顯示位于右側腦室和第三腦室的殘余腫瘤體積減小，腫塊部分得到一定緩解，文章說明該腫瘤對PTEN通路的生長有很強的依賴性，因此可通過對這種依賴性的識別，為患者提供個性化治療方案。研究揭示通過對膠質瘤患者類器官進行基因組測序以觀察其基因突變情況，從而針對特定的基因突變進行相應的藥敏實驗，繼而實現個性化治療，這一操作在臨床診治中具有可行性。

上述個體化精準腫瘤數據的實質是通過基于測序，分析體患者腫瘤的基因組和識別出突變基因及突變位點，為個性化治療提供依據。與傳統的長期培養的腫瘤細胞系模型相比，膠質瘤類器官的優勢在于能夠更準確地總結疾病的分子特征和生物學特性。與PDX模型相比，膠質瘤類器官縮短了建模實驗，也降低了模型成本[21-22]。更重要的是，使用膠質瘤類器官進行化學篩選具有顯著的優勢，因為它易于培養，研究材料豐富，這對產生可靠的藥物反應參數是必要的。膠質瘤類器官代表了每個相應腫瘤的獨特生物學特性，并為評價藥物反應提供了更準確的模型系統。Jacob[23]等曾對膠質瘤類器官進行不同處理，藥物處理包括替莫唑胺 、吉非替尼、曲米替尼、埃弗雷莫斯，以及輻射處理，結果發現，不同來源的膠質瘤類器官對不同方式治療的反應存在很大的差異，其治療效果與腫瘤的突變方式、類型以及通路富集具有很高的一致性，作者認為這一成果可揭示膠質瘤類器官在對個性化藥物治療的快速選擇、功能測試具有重要意義。

免疫治療模型

近年來，免疫治療在臨床應用中表現出了較好的臨床效果，在腫瘤的治療中表現出良好的潛力，已有部分研究發現了患者來源的膠質瘤大腦類器官可以用于模擬免疫治療的效果。Jacob[23]等通過對GBO突變譜與對特定藥物的反應相關聯，并通過建模嵌合抗原受體T細胞免疫治療來測試治療效果，具體方法是將與EGFRvⅢ+腫瘤細胞有特意反應的CAR-T細胞與膠質母細胞瘤類器官共培養，結果揭示該膠質母細胞瘤類器官模型表現出了特有的細胞效應，即當CAR-T細胞增殖時，對表達EGFRvⅢ的細胞殺傷作用顯著，使其數量減少，但不殺傷表達EGFR+EGFRvⅢ-的腫瘤細胞，反應出膠質母細胞瘤類器官在利用內源性靶點快速檢測抗原特異性CAR-T細胞治療效果方面的可用性。Neal等[24]將患者源的腫瘤類器官與含有內源性、同基因型的腫瘤浸潤淋巴細胞共培養，發現淋巴拎包細胞保留了原有腫瘤T細胞受體譜，并保留了程序性細胞死亡因子1（PD-1）依賴的免疫檢測點，阻斷PD-1激活的抗原特異性腫瘤浸潤淋巴細胞引發的腫瘤細胞毒性。PD-1是腫瘤細胞逃離機體免疫殺傷的重要免疫抑制靶點，與膠質瘤關系密切，該發現有望針對膠質瘤患者的康PD-1治療得以進行體外測試，但作者并未進行該方向的深入研究。

構建患者來源的原位異種移植

患者來源的異種移植（PDXs）是一種成熟的臨床前癌癥模型，即在在免疫缺陷小鼠中植入患者腫瘤，進行研究。PDXs模型通常通過皮下或原位植入患者腫瘤組織碎片獲得，但對于膠質瘤，建模成功率較低，僅為50%[25]。且將腫瘤碎片直接植入大腦在技術上難度極高，不易成功?；颊邅碓吹脑划惙N移植（PDOXs）建立在大腦植入神經膠質瘤技術的可行性和標準化，可避免神經膠質瘤的選擇和適應，對于研究腫瘤的組織病理學特點和時間特異性意義重大。不同的膠質瘤類器官培養模式在異種腦移植時產生的腫瘤存在差異，有利于研究膠質瘤患者的組織病理學特征，如侵襲性、血管生成等。此外，研究人員已經證明DOXs可以在小鼠體內保持穩定幾代。PDOXs的應用范圍從體內藥物驗證研究、磁共振成像方案優化、利用同位素示蹤劑動態分析體內腫瘤代謝、遺傳和表型分析，到識別新的生物標志物和治療靶點。因此，這種PDOXs模式為下游的研究提供豐富材料。

研究膠質瘤的發生發展

膠質瘤細胞的擴散侵襲性是其臨床治療的一大難點，其侵襲的作用機制尚不明確。膠質瘤細胞遷移侵襲的過程會表現出不同干細胞標志物的表達，可依據這一特點預測患者的治療。建立一個膠質瘤細胞侵襲正常組織的體外模型可為這一研究提供良好的平臺。Linkus 等將類器官與膠質瘤干細胞共培養，結果顯示形成的膠質瘤細胞浸潤腦組織的模式與膠質瘤患者手術發現的情況相似，不同患者來源的膠質瘤類器官增殖、遷移、侵襲模式不同。動物模型方面，da Silvia等[26]將取自患者的膠質瘤球體與小鼠胚胎干細胞來源的大腦類器官共培養，發現膠質瘤球體可自行附著于類器官，并逐漸與其融合，最后侵襲腦組織中，表現出較強的侵襲能力。Ogawa 等[27]將腫瘤類器官注入了免疫缺陷小鼠的海馬單側位，通過HE染色發現這些腫瘤細胞會沿著血管開始擴散，顯示出了廣泛的侵襲性和細胞核多形性，與患者膠質瘤具有相似的生物學特性;在腫瘤冰罩周圍發現了大量Ki-67，CD31，預示著腫瘤組織高度血管生成過程，并且發現了膠質瘤干細胞標志物，證實了類器官來源的腫瘤細胞具有患者腫瘤的生物學特征，可作為膠質瘤研究的良好材料。這些研究也表明，類器官模擬膠質母細胞侵襲培養時間短、移植成功率高、侵襲性強，且保留腫瘤關鍵生物學特征，為研究膠質瘤的作用機制提供基礎。未經治療的神經膠質瘤類器官可以在模型中引起腫瘤，治療的神經膠質瘤類器官也可引起腫瘤。這類模型可用于研究治療前后腫瘤的變化。從同一患者不同時間點采集的腫瘤樣本也可以生成成對的縱向模型，從而再現疾病隨時間的進展【28】。

腫瘤微環境

膠質瘤不是一種細胞自主的疾病，而是一種癌細胞與宿主細胞生物學密切相關的疾病，膠質瘤細胞可擴散、侵襲周邊的正常腦組織繼而造成患者死亡。腫瘤微環境的研究對分析膠質瘤的異質性、可塑性和進化過程中發具有重要意義【29】。膠質瘤干細胞不僅可以更新、增殖[30-31]、分化成不同的腫瘤細胞，還可以通過與細胞間質、細胞外間質、腫瘤相關成纖維細胞、免疫細胞、分化神經細胞等不同腫瘤成分相互作用，造成腫瘤的進一步惡性轉化，也可增加腫瘤治療時的耐藥性[32]。Oberheim等[33]曾建立一種患者來源膠質瘤類器官的小鼠移植模式，該模型并不理想，雖解決了宿主-腫瘤細胞相互作用的問題，但在解剖學上存在物種差異，且發現細胞水平，星形細胞樹突狀復雜性、鈣瞬態傳輸速度等也存在明顯差異，因此腫瘤微環境的研究并未深入。隨著類器官培養技術不斷提升，已有可培育出成熟的膠質瘤類器官，用于研究腫瘤微環境。

膠質瘤類器官模型解決了傳統的二維培養無法模擬的許多局限性，打破了保存親代腫瘤的細胞和突變多樣性方面的局限性，它允許人們在類似于原始人類大腦的微環境中體外研究患者特異性膠質瘤細胞。腦器官生長患者的膠質瘤的生物學行為和組織病理學特征與手術和尸檢標本密切相關，證明了該模型的臨床相關性。膠質瘤類器官維持患者特異性EGFR擴增和磷酸化RTK信號，以及膠質瘤樣器官微管的自發形成，原位的微結構特征也進一步證實了這一點。膠質瘤類器官模型允許體內腫瘤物質在足夠的腦微環境中增殖，包括結構（血管系統、血腦屏障）、細胞（神經元、膠質、小膠質細胞/巨噬細胞）和代謝成分（腦脊液、間質液）。該方法還可避免因體外長期培養和類器官擴增而導致微環境丟失、變化和細胞異常。

總結

雖然膠質瘤類器官的使用為膠質瘤的診斷和治療帶來了新的機遇，但也有幾個主要的問題：首先是，大腦類器官成熟度爭議，有研究認為腦類器官成熟過低，相當于孕期胎兒成熟度，而膠質瘤干細胞更善于侵入成熟的大腦[34-35]，但隨著技術的不斷進步，逐漸培養出更接近成熟的人類大腦類器官。其次，缺乏完整的腫瘤微環境，膠質瘤是一種晚發性疾病，理想的模型需要具有成熟細胞類型的星形膠質細胞、少突膠質細胞、髓鞘神經元和小膠質細胞免疫防御細胞類型的腦器官[36-37]，目前技術水平尚不能完全實現。再次，缺乏內皮細胞形成的血管網絡，血管的形成對類器官中氧氣以及營養物質的運輸尤為重要[38]，最近發展了幾種體外誘導大腦器官血管形成的方法[39-40]，但仍需進一步研究。雖然大腦類器官在膠質瘤的研究中有許多方面需要改進，但其在基因水平和形態學能很好的再現腫瘤特征，在臨床研究和治療仍是一個重要研究方向，隨著技術的不斷進步，必將為膠質瘤的研究提供更好前景。

參考文獻：

[1] Louis DN， Perry A， Reifenberger G， et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system： a summary[J]. Acta Neuropathol，2016，131：803–20.

[2] De Witt HP， Van Tilborg AA， Eijk PP， et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids[J]. Oncogene，2008， 27： 2091–6.

[3] Wang X， Prager BC， Wu Q，et al. Reciprocal signaling between glioblastoma stemcells and differentiated tumor cells promotes malignant progression[J]. Cell Stem Cell，2018，22：514–28.

[4] Lee J， Kotliarova S， Kotliarov Y， et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines[J]. Cancer Cell，2006，9：391–403.

[5] Li A， Walling J， Kotliarov Y， et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas[J]. Mol Cancer Res.2008，6：21–30.

[6] Torsvik A， Stieber D， Enger P， et al. U-251 revisited：genetic drift and phenotypic consequences of long-term cultures of glioblastoma cells[J]. Cancer Med，2014， 3：812–24.

[7] Qian X， Nguyen HN， Song MM，et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure[J]. Cell，2016，165：1238–54.

[8] 王蘭林，戚仁莉，余化霖.三維細胞培養技術在膠質瘤細胞培養中的應用研究[J].現代醫藥衛生，2021，37（12）：2029-2032.

[9] Auffinger B， Tobias AL， Han Y， Lee G， et al. Conversion of differentiated cancer cells into cancer stem-like cells in a glioblastoma model after primary chemotherapy[J]. Cell Death Differ，2014，21：1119–31.

[10]Cabrera MC， Hollingsworth RE， Hurt EM. Cancer stem cell plasticity and tumor hierarchy[J]. World J Stem Cells， 2015，7：27–36.

[11]Gupta PB， Pastushenko I， Skibinski A， et al. Phenotypic plasticity： driver of cancer initiation， progression， and therapy resistance[J]. Cell Stem Cell，2019，24：65–78.

[12]Seino T， Kawasaki S， Shimokawa M， et al. Human pancreatic tumor organoids reveal loss of stem cell niche factor dependence during disease progression[J]. Cell Stem Cell， 2018，22： 454–67.

[13]Bleijs M， van de Wetering M， et al. Xenograft and organoid model systems in cancer research [J]. Embo J，2019，38：e101654.

[14] Tuveson D， Clevers H. Cancer modeling meets human organoid technology[J].Science，2019， 364：952–5.

[15]孫慧，趙麗嬌，魯靜，等.3D培養在神經膠質瘤研究中的應用[J].現代腫瘤醫學，2019， 27（06）：1090-1094.

[16]Tirosh I， Suvà ML. Tackling the many facets of glioblastoma heterogeneity[J].Cell Stem Cell， 2020，26：303–4.

[17]Linkous A， Balamatsias D， Snuderl M， et al. Modeling Patient-Derived Glioblastoma with Cerebral Organoids[J]. Cell Rep， 2019 19，26（12）：3203-3211.

[18]Zhang L， Liu F， Weygant N， Zhang J， et al. A novel integrated system using patient-derived glioma cerebral organoids and xenografts for disease modeling and drug screening[J]. Cancer Lett， 2021，500：87–97.

[19] Drost J， Clevers H. Organoids in cancer research[J]. Nat Rev Cancer，2018，18：407–18.

[20]Loong HH， Wong AM， Chan DT， et al. Patient-derived tumor organoid predicts drugs response in glioblastoma： a step forward in personalized cancer therapy？ [J].Clin Neurosci，2020，78：400–2.

[21]Holbeck SL， Collins JM， Doroshow JH. Analysis of Food and Drug Administration-approved anticancer agents in the NCI60 panel of human tumor cell lines[J]. Mol Cancer Ther，2010，9： 1451–60.

[22]Joo KM， Kim J， Jin J， et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ[J]. Cell Rep，2013， 3：260–73.

[23]Jacob F， Salinas RD， Zhang DY， et al. A Patient-Derived Glioblastoma Organoid Model and Biobank Recapitulates Inter- and Intra-tumoral Heterogeneity[J]. Cell， 2020 Jan 9，180（1）：188-204.

[24]Neal JT ，Li X ，Zhu J，et al . Organoid modeling of the tumor immune microenvironment [J].Cell ，2018，175（7）：1972 -1988 .

[25] Vaubel RA， Tian S， Remonde D， et al. Genomic and phenotypic characterization of a broad panel of patient-derived xenografts reflects the diversity of glioblastoma[J]. Clin Cancer Res，2020，26：1094–104.

[26]da Silva B ，Mathew RK ，Polson ES ，et al.Spontaneousglioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion[J].LAS Discov ，2018，23（8）： 862-868.

[27]Ogawa J，Pao GM ，Shokhirev MN ，et al . Glioblastoma mod-el using human cerebral organoids[J]. Cell Rep ，2018 ，23（4）：1220-1229.

[28]Golebiewska A， Hau AC， Oudin A， et al. Patient-derived organoids and orthotopic xenografts of primary and recurrent gliomas represent relevant patient avatars for precision oncology[J]. Acta Neuropathol，2020，140：919–49.

[29]Charles N， Ozawa T， Squatrito M， et al. Perivascular nitric oxide activates notch signaling and promotes stem-like character in PDGF-induced glioma cells[J].Cell Stem Cell， 2010，6：141–52.

[30] Man J， Shoemake J， Zhou W， et al. Sema3C promotes the survival and tumorigenicity of glioma stem cells through Rac1 activation[J]. Cell Rep，2014，9：1812–26.

[31] Fan X， Khaki L， Zhu TS， et al. NOTCH pathway blockade depletes CD133-positive glioblastoma cells and inhibits growth of tumor neurospheres and xenografts[J]. Stem Cells，2010，28：5–16.

[32] Cheng L， Huang Z， Zhou W， et al. Glioblastoma stem cells generate vascular pericytes to support vessel function and tumor growth[J]. Cell，2013，153：139–52.

[33] Oberheim NA， Takano T， Han X， et al. Uniquely hominid features of adult human astrocytes[J]. J Neurosci，2009，29：3276–87.

[34]Qian X， Nguyen HN， Jacob F， et al. Using brain organoids to understand Zika virus-induced microcephaly[J]. Development，2017，144：952–7.

[35] Goranci-Buzhala G， Mariappan A， Gabriel E， R et al. Rapid and efficient invasion assay of glioblastoma in human brain organoids[J]. Cell Rep，2020，31：1077-38.

[36]Hambardzumyan D， Gutmann DH， Kettenmann H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression[J]. Nat Neurosci，2016，19：20–7.

[37]Abels ER， Maas S， Nieland L， et al. Glioblastoma-associated microglia reprogramming is mediated by functional transfer of extracellular miR-21[J]. Cell Rep，2019，28：3105–19.

[38]Javaherian A， Kriegstein A. A stem cell niche for intermediate progenitor cells of the embryonic cortex[J]. Cereb Cortex，2009，19（Suppl 1）：i70–7.

[39]Cakir B， Xiang Y， Tanaka Y， et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system[J]. Nat Methods， 2019，16：1169–75.

[40]Pham MT， Pollock KM， Rose MD， et al. Generation of human vascularized brain organoids[J]. NeuroReport，2018，29：588–93.