環介導等溫擴增技術中對低濃度病原體擴增的改進

龐媛媛 盧志賢 任惠明

摘要：目的 改進環介導等溫擴增技術（LAMP），探討其在病原體檢測中的檢測限。方法 以結核分枝桿菌核酸檢測為實例，建立兩組閉管LAMP反應系統：使用錫紙隔離SYBR greenⅠ的反應組及提前加入鈣黃綠素染料及輔顯劑（溴酚藍）的反應組，評估兩種方法的檢測限、污染控制性、直觀結果讀取，與常規PCR方法作比較。結果 兩種閉管分析系統的LAMP技術的檢測限為3×100拷貝/μl，高于普通PCR技術的檢測限（3×101拷貝/μl），同時兩種閉管分析方法未出現污染情況，溴酚藍作為輔顯劑可使陰性樣本反應后呈淡紫色，陽性樣本反應后呈綠色，更易于直觀結果讀取。結論 隔離SYBR greenⅠ建立閉管LAMP反應系統及提前加入鈣黃綠素染料及輔顯劑（溴酚藍）的閉管LAMP反應系統均具有防污染、低檢測限，且加入輔顯劑更易于檢測限附近的直觀結果觀察，適合在多種LAMP檢測試劑盒中推廣應用。

關鍵詞：環介導等溫擴增技術;輔顯劑;病原體檢測;檢測限

【中圖分類號】R4 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-9026（2022）02-01

環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的核酸擴增技術，自問世以來其以獨特的等溫擴增反應模式擺脫了常規PCR核酸擴增反應中對溫度循環儀器的要求，從而極大簡化了反應的過程，同時也降低了檢測成本，且由于LAMP反應中特殊的引物設計還進一步增強了該反應的敏感性和特異性，使得該技術非常適合作為病原微生物的現場快速診斷方法[1，2]。但也由于LAMP技術過高的靈敏度也帶來了更加嚴峻的反應后擴增產物的污染問題和極低濃度結果的直觀判斷。本研究以結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）核酸檢測為實例，擬建立以閉管分析及溴酚藍為輔顯劑的LAMP改進技術，并探討其在病原體檢測中的檢測限。

1資料與方法

1.1材料和試劑

MTB Rv株DNA、MTB Rv株DNA LAMP檢測試劑盒均由解放軍結核病研究所提供，溴酚藍為天津市科密歐化學試劑有限公司產品（AR）。

1.2方法

1.2.1MTB基因組DNA稀釋試驗

取濃度為3×104拷貝/μl的結核桿菌Rv株DNA原液，按照10倍的梯度稀釋5次，最后取3×104、3×103、3×102、3×101 、3×100及3×10-1拷貝/μl濃度模板進行后面的LAMP反應。以純水作為陰性對照用液。

1.2.2隔離SYBR greenⅠ的LAMP閉管分析方法

LAMP反應前將錫紙折疊成凹狀后塞入EP管內上端，紙壁與管壁之間留有較小空間縫隙，在錫紙凹狀紙壁上滴2μl SYBR greenⅠ，由于染料無法滲透過錫紙，故反應前利用錫紙與管壁的摩擦力克服錫紙本身與染料的重力，使得原本會抑制反應的染料在反應過程中停留在錫紙的凹狀紙壁內無法進入反應液中，反應后用離心機離心反應管使染料從紙壁與管壁間的縫隙中落入反應液，從而完成了不開蓋的檢測過程[3]。

1.2.3提前加入鈣黃綠素染料及輔顯劑（溴酚藍）的LAMP閉管分析方法

LAMP反應前提前加入鈣黃綠素染料及溴酚藍溶液2μl，然后再按LAMP反應操作進行。

1.2.4LAMP反應及PCR反應

LAMP反應及PCR反應均按MTB基因各自的檢測試劑盒說明書進行操作[4]。所用的MTB基因引物序列共計6條，見表1。LAMP反應條件：水浴63℃，加熱45min。空白對照模板為水。PCR反應模板設置同LAMP一致，上下游引物分別為LAMP第一組引物中的F3，B3。反應程序為94℃1min（變性），60℃1min（退火），72℃90s（延伸），30個循環。反應后LAMP結果和PCR結果根據2%瓊脂糖凝膠電泳判定。

2結果

反應結束后，分別觀察提前加入鈣黃綠素染料的反應組和使用錫紙隔離SYBR greenⅠ組反應后的顏色變化。通過肉眼觀察顏色判定結果，兩種閉管系統LAMP方法所能檢測到的模板拷貝數極限值為3×100拷貝/μl，而常規PCR方法檢測限為3×101拷貝/μl，兩種閉管體系LAMP檢測技術檢測限優于常規PCR方法，經過多次實驗均未出現假陽性的發生。

3討論

LAMP等各種分子生物學診斷技術之所以難以大范圍的推廣應用，一方面是昂貴的診斷成本限制了其大范圍的普及[5，6]，另一方面不論是PCR還是LAMP，由于其極高的擴增效率，反應后一旦開蓋很容易造成環境中大量的氣溶膠污染，給后續的檢測帶來干擾，容易導致一部分假陽性結果[7]。本研究在保證特異性的同時為了降低反應擴增產物污染所帶來的假陽性，提高結果可信度，使用了兩種不開蓋檢測擴增結果的方法，從而避免了反應后開蓋檢測所導致的氣溶膠污染。其中提前加入染料的方法利用反應前氯化錳和鈣黃綠素結合抑制了鈣黃綠素本身的綠色熒光，反應后由于陽性樣本伴隨目標基因的擴增產生了大量的副產物：焦磷酸根離子，焦磷酸根離子剝奪了鈣黃綠素上的錳離子從而使得鈣黃綠素本身的熒光得以釋放[8]。在實際使用中我們發現原始配方的染料陰性與陽性樣本之間的區分有時并不很明顯，由于原染料對于陰性樣本反應后顯淡橙黃色，陽性樣本反應后顯淡綠色，在顏色光譜上這兩種顏色是緊挨在一起的兩個區域，故實際中會對弱陽性的結果判定造成一定程度的困擾。針對這種情況我們改進了原染料的配方，在原始配方的基礎上加入了溴酚藍作為輔顯劑，加入輔顯劑后，陰性樣本反應后呈淡紫色，陽性樣本反應后呈綠色，從色輪圖上可見這兩種顏色間隔相對較遠，肉眼分辨這兩種顏色相對較容易。而錫紙隔離SYBR greenⅠ組是由于染料中的主要配方鈣黃綠素配置成溶液后穩定性較低，故我們自主設計了一種新型的不開蓋檢測方法，利用錫紙隔絕SYBR greenⅠ染料在反應過程中同反應液的接觸，反應后通過離心使染料落入反應液指示反應結果，整個檢測過程均可在閉管體系內完成，該方法簡單易行同時SYBR greenⅠ保存較鈣黃綠素染料容易，不需要每次試驗前重新配置染料，使得該方法相對于鈣黃綠素染料法更加方便。我們的檢測發現，無任是提前加入鈣黃綠素染料的反應組還是使用錫紙隔離SYBR greenⅠ組，其所能檢測到的模板拷貝數極限值為3×100拷貝/μl，而常規PCR方法檢測限為3×101拷貝/μl，兩種閉管體系LAMP檢測技術檢測限優于常規PCR方法，經過多次實驗均未出現假陽性的發生。且加入溴酚藍作為輔顯劑（雖然加入輔顯劑后對于擴增效率會有一定程度的限制，延長了一部分反應時間，但對于結果判定具有顯著優勢）更易于直觀結果的讀取，適合在多種LAMP檢測試劑盒中推廣應用[9]。

參考文獻：

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[9]劉亞東，冷雪，時坤，等.環介導等溫擴增技術檢測方法的研究進展[J].中國人獸共患病學報，2018，34（5）：460-465.