多組學技術在非小細胞肺癌脾虛濕滯證中的應用研究

陳卓 馬冠君 錢祥 傅曉璇 張愛琴

中國科學院大學附屬腫瘤醫院（浙江省腫瘤醫院） 中國科學院基礎醫學與腫瘤研究所 杭州 310022

系統生物學是以現代不斷發展的生物實驗技術為基礎的一門新興學科，研究方法包括轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學、腸道微生態學等。中醫證候是中醫理論對機體某階段功能狀態的描述，是疾病發生和演變過程中某階段生理、病理狀態的高度概括，因此證候具有即時性、動態性、整體性的特點[1]。系統生物學的概念，與中醫的整體觀念相似，運用系統生物學方法研究中醫證候，有利于從客觀上揭示證候的本質。肺癌是目前世界范圍內發病率（約占全球癌癥總病例的11.6%）和死亡率（約占全球總癌癥死亡人數的18.4%）最高的惡性腫瘤[2]。脾虛濕滯證是肺癌的常見證候，健脾祛痰方藥治療本證具有較好療效[3]。本研究運用16S核糖體DNA（16S ribosomal DNA，16S rDNA）鑒定和液相色譜-質譜聯用（liquid chromatograph-mass spectrometry，LC-MS）技術對非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）脾虛濕滯證進行了蛋白質組學、代謝組學和腸道微生態學的研究，旨在為NSCLC的中醫證候診斷提供生物學基礎，為今后開展中醫藥抗癌治療提供實驗依據。

1 對象和方法

1.1 診斷標準 經組織病理學和（或）細胞學確診為NSCLC[4]。符合《中醫臨床診療術語證候部分》脾虛濕滯證的診斷標準：以面目肌膚淡黃，甚則晦暗不澤，肢體乏力，食少納呆，大便溏薄，舌質淡苔薄，脈濡細等為常見證候[5]。

1.2 納入、排除及脫落標準

1.2.1 納入標準 （1）符合診斷標準；（2）無其他惡性腫瘤病史；（3）符合中醫辨證標準；（4）性別不限，年齡18～75歲；（5）患者本人同意，并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準 （1）近3周內使用過抗生素治療；（2）有精神疾病，無完全民事行為能力。

1.2.3 脫落標準 （1）患者依從性差；（2）患者要求終止試驗。

1.3 一般資料 本研究對象為2019年3月至9月于浙江省腫瘤醫院胸部外科門診就診的NSCLC患者共13例，入組前未行任何治療，均擬行肺癌根治術，由中醫科兩名副主任以上的中醫師同時辨證為脾虛濕滯證。性別比男:女為5:8，年齡36～75歲，平均（56.69±11.28）歲，惡性腫瘤國際臨床病期分類（tumor node metastasis classification，TNM）：原位癌1例，Ⅰa期11例，Ⅰb期1例。 同時招募健康志愿者15例，要求經體格檢查及實驗室檢查排除心腦血管、肝腎、內分泌等重要系統疾病，且近3周內無感染性疾病，未使用抗生素。本臨床研究通過浙江省腫瘤醫院倫理委員會審核（批準號：IRB-2018-219）。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 腸道微生態分析 采集受試者自然排出至無菌容器內的新鮮糞便，迅速置于取樣試管中，并于1 h內運至實驗室進行樣品前處理。稱取糞便樣本200 mg，加入30 mL緩沖溶液，充分振蕩混勻，1 000 r/min離心5 min后收集沉淀，以10 mL緩沖溶液重懸。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit對糞便微生物DNA進行提取。提取后，以瓊脂糖凝膠電泳和ThermoNanoDrop 2000紫外微量分光光度計進行總DNA質檢。對樣本進行16S V3-V4區域擴增，引物信息：正向：CCTACGGGNGGCWGCAG；反向：GACTACHVGGGTATCTAATCC。 本研究所用引物由杭州聯川生物技術有限公司代為合成。將稀釋后的基因組DNA作為模板，使用Phanta Max Master Mix（Vazyme）高保真酶進行聚合酶鏈式反應 （polymerase chain reaction，PCR）。 反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，重復25個循環；最后72℃持續5min。反應體系：2×Phanta Max Master Mix（Vazyme）25 μL，引物各2 μL，加入ddH2O至50 μL。 取PCR產物1.5 μL，2%瓊脂糖凝膠電泳后，使用凝膠成像系統進行紫外成像并拍照。

文庫質檢合格后，使用量子位（Qubit）對混合文庫pool進行濃度定量，并依據每個樣品的數據量要求進行相應的比例混合，最后運行測序儀（Miseq）測序程序。將序列完全一樣的原始測序數據（clean reads）根據豐度大小進行排序，把其中的Singletons過濾掉，利用Usearch對0.97相似度進行聚類，并進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）劃分，最后將所有clean reads與OTU序列進行比對，將能比對上OTU的Reads提取出來，得到最終的比對后數據（mapped reads）。

1.4.2 蛋白質組學分析 采集受試者空腹外周血5 mL，靜置30 min后3 000 r/min離心分離血清。在待測血清樣本中加入裂解液，沸水浴15 min，-20℃下14 000 r/min離心15 min，取上清液。分裝樣品，-20℃低溫保存。鑒定每個樣本中蛋白，進行電泳并定量。取蛋白提取物30 μg，加入8 mol·L-1尿素200 μL并充分混合，-20℃下14 000 r/min離心15 min，濃縮液加入8 mol·L-1尿素200 μL，并以pH8.5的0.1 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽稀釋后離心濃縮。濃縮液以胰蛋白酶消化，消化液以0.5 mol·L-1氯化鈉溶液50 μL沖洗后再離心。將得到的溶液與10%三氟乙酸結合并酸化，酸化后脫鹽、活化、平衡、肽洗和洗脫，以50%乙腈兩次漂洗活化，再以0.1%三氟乙酸水溶液兩次漂洗平衡。將富含多肽的溶液緩慢抽吸后洗滌脫鹽，然后洗脫真空干燥，再以0.1%甲酸30 μL懸浮。含脫鹽肽3 μL的溶液采用納流液相色譜儀系統進行在線納米流動液相色譜分離。將液相色譜儀連接到內徑為100 μm的預柱上，填充5 μm C18樹脂，柱前反應后，以3 μm C18樹脂填充75 μm×15 cm毛細管柱，通過逐步梯度洗脫從柱前和分析柱上洗脫多肽。在Maxquant1.6的UniProt人類蛋白序列數據庫中搜索所有的原始文件，以Perseus統計各亞組的折疊變化。數據框中變化大于兩倍（＞2或＜0.5）的蛋白質組被標記為顯著改變的蛋白質。

1.4.3 代謝組學分析 采集受試者空腹外周血5 mL，靜置30 min后3 000 r/min離心分離血清，-80℃保存。取血清樣本200 μL，室溫下冰上解凍，加入-20℃過夜的甲醇乙腈（11）600 μL，渦旋30 s，4 ℃下14 000 r/min離心15 min，取上清液置離心管中，真空離心濃縮干燥。干燥后加入乙腈/甲醇（80/20）-水混合溶液（1:1）復溶，渦旋60 s，4 ℃下14 000 r/min離心15 min，取上清液4 μL進行LC-MS分析。

待測樣品采用ExionLCAD超高效液相色譜系統（Ultra Performance Liquid Chromatography，UHPLC）ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）進行分離，進樣盤溫度4℃；柱溫40℃；進樣量4 μL；流動相組成A：乙腈（含0.1%甲酸），B：水（含0.1%甲酸）；以0.3 mL/min的流速進行洗脫，洗脫梯度：0～1 min，95%B；1～20 min，95%～1%B；20～23 min，1%B。樣品經UHPLC分離后用X-500R質譜儀進行質譜分析。通過單、多維統計分析篩選得到具有差異有統計學意義的離子（P＜0.05），差異倍數（fold change，FC）＞1.5且變量影響投影（variable influence on projection，VIP）＞1.0，作為潛在生物標記物。

1.4.4 腸道微生態-代謝組學聯合分析 對篩選得到的差異二級代謝物和16S測序獲得的差異具有統計學意義的屬水平菌群進行Spearman相關性分析，獲得差異菌群與差異菌群，差異代謝物與差異代謝物，差異代謝物與差異菌群之間的關系?；谟嬎憬Y果選擇合適的篩選條件，獲得最終的差異代謝物與差異代謝物的相關關系及網絡圖等。

1.4.5 蛋白質組學-代謝組學聯合分析 通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）將代謝組學和蛋白質組學數據聯合起來，找到同一生物進程中發生顯著性變化的蛋白質和代謝物，快速鎖定關鍵基因。主要分為以下幾步：（1）通過KEGG代謝通路進行蛋白質組與代謝組關聯；（2）顯著差異數據和調控關系對數據篩選；（3）基因本體（gene ontology，GO）和KEGG富集分析；（4）關聯數據表達模式聚類；（5）關聯數據網絡圖繪制。

1.5 統計學分析 采用SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析。采用秩和檢驗找出差異腸道菌群，以P＜0.05為差異有統計學意義，同時對所有的P值進行錯誤發現率（false discover rate，FDR）校驗。在差異蛋白分析中，生物學重復組間比較，將FC為1.2（上下調）且P＜0.05的蛋白視為差異表達蛋白。有生物學重復的兩組樣本之間的比較采用t檢驗。兩組樣本間的差異代謝物分析采用單變量分析，以FC＞1.5且P＜0.05作為篩選標準，從而篩選潛在的標志代謝物。聯合分析采用斯皮爾曼相關系數 （Spearman correlation coefficient，SCC），相關系數以r表示，r的絕對值越大表明相關性越強。

2 結果

2.1 微生態組間差異

2.1.1 維恩圖 16S rDNA測序分析結果顯示，本研究中28個樣本共產生了254個OTU，患者組有34個獨有的OTU，對照組有67個獨有的OTU，兩組有153個共有OTU，相較于對照組，患者組的腸道菌群差異有統計學意義（P＜0.05）。 見圖1。

圖1 OTU韋恩圖Fig.1 OTU Venn diagram

2.1.2 差異物種分析 組間群落差異 （LDA effect size，LEfSe）分析提示，患者組布魯菌、鞘氨醇單胞菌豐度水平明顯低于對照組，脫硫弧菌明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 LEfSe分析圖Fig.2 Plot of LEfSe analysis

2.1.3 差異物種Spearman相關分析 通過差異物種Spearman相關分析發現，埃希菌屬/志賀桿菌屬（Escherichia/Shigella） 與腸桿菌目（Enterobacteriales）存在正相關關系（r=0.52，P＜0.05），鏈球菌屬與放線菌屬也存在正相關關系（r=0.66，P＜0.05）。 見圖3。

圖3 豐度top 30的差異物種相關性系數分析Fig.3 Correlation coefficient analysis of differential species for top 30 abundance

2.2 蛋白質組學組間差異

2.2.1 差異蛋白統計分析 蛋白定量分析提示，與對照組比較，患者組有9個上調蛋白和5個下調蛋白，共計14個差異蛋白。見圖4。

圖4 差異蛋白圖Fig.4 Differential protein map

2.2.2 差異蛋白基因功能分析 GO富集分析結果顯示細胞外間隙、細胞外外泌體、胞外區等通路上富集明顯。見圖5。

圖5 GO富集散點圖Fig.5 GO enrichment scatter plot

2.2.3 差異蛋白KEGG通路分析 KEGG富集分析結果顯示，在補體信號通路（complement and coagulation cascades）、Pertussis、 磷脂酰肌醇 3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositide 3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）等通路上富集明顯。見圖6。

圖6 KEGG富集散點圖Fig.6 KEGG enrichment scatter plot

2.3 代謝組學組間差異 將P＜0.05和FC＞1.5的代謝物作為差異代謝物，進一步采用MetDNA和OSI/SMMS軟件進行代謝物結構鑒定。見表1。差異代謝物強度比對柱狀圖見圖7。本項目共鑒定出差異代謝物13個，其中負離子模式下2個、正離子模式下11個。將得到的差異代謝物上傳到Metaboanalyst 4.0網站，進行代謝通路分析。分析結果顯示，差異代謝物主要涉及卟啉和葉綠素代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、視黃醇代謝、泛酸和輔酶A（coenzymeA，CoA）生物合成、脂肪酸降解、初級膽汁酸生物合成、脂肪酸生物合成、氨?；?tRNA生物合成和類固醇激素生物合成等代謝通路。見圖8。

表1 差異代謝物Tab.1 Differential metabolites

圖7 差異代謝物強度比對柱狀圖Fig.7 Histogram of differential metabolite intensity ratios

圖8 差異代謝物富集代謝通路示意圖Fig.8 Schematic diagram of the differential metabolite enrichment metabolic pathway

2.4 腸道微生態-代謝組學聯合分析

2.4.1 差異代謝物-差異菌群相關性分析 通過菌群-代謝物聯合分析發現，瘤胃球菌與膽紅素存在正相關關系，與纈氨酸、糞卟啉存在負相關關系。鏈球菌與纈氨酸存在正相關關系。狄氏副擬桿菌與纈氨酸、（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）-二十二碳六烯酸存在負相關關系，與維生素A醛、氫化黃體酮存在正相關關系。見圖9。

圖9 差異代謝物-差異菌群關聯熱圖Fig.9 Heat map of differential metabolite-differential flora association

2.4.2 差異代謝物與菌群網絡調控分析 代謝物-菌群網絡調控分析提示，纈氨酸與鏈球菌、瘤胃球菌、氣單胞菌呈正相關，與狄氏副擬桿菌、嗜膽菌呈負相關。見圖10。

圖10 差異代謝物與菌群網絡調控圖Fig.10 Diagram of differential metabolite and colony network regulation

2.5 蛋白質組學-代謝組學聯合分析 蛋白質組學-代謝物聯合分析提示，患者組差異蛋白質和信號通路包括基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、90kDa熱休克蛋白 β1（heat shock protein 90kDa β1，HSP90β1）、纖連蛋白1（fibronectin 1，FN1）、整合素2B（integrin alpha2B，ITGA2B）、胰島素樣生長因子2受體（insulin-like growth factor 2 receptor，IGF2R）、巨噬細胞集落刺激因子1受體（macrophage colony-stimulating factor 1 receptor，CSF1R）、 血小板源生長因子受體 （platelet-derived growth factor receptor，PDGFRG）及下游代謝物雄烯二酮與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、PI3K-Akt、Ras信號通路、癌癥信號通路、細胞因子受體相互作用 （cytokine-cytokine receptor interaction）信號通路，這5條通路具有相關性。見圖11。

圖11 差異蛋白質與差異代謝物關聯網路圖Fig.11 Differential protein and differential metabolite association network map

3 討論

脾虛濕滯證是肺癌的常見證候，臨床主要表現為面目肌膚淡黃，甚則晦暗不澤，肢體乏力，食少納呆，大便溏薄，舌質淡苔薄，脈濡細等癥狀[5]。運用微生態組學研究中醫證候，有助于從客觀上揭示證候的本質。腸道微生物是宿主不可忽視的一部分，符合中醫基礎理論中的“整體觀”[6]，而腸道菌群的現代研究拓展了“臟腑學說”中“肺與大腸相表里”的理論[7]。當腸道菌群失調時，宿主將出現中醫“脾虛濕滯證”的臨床表現。由此，筆者假設可通過觀察NSCLC脾虛濕滯證患者腸道微生態的差異，并研究該證型的生物學基礎，以此來闡釋證候的科學內涵。

通過差異物種分析，本研究發現兩組受試者間具有顯著差異的菌屬共有3種，其中脫硫弧菌在NSCLC脾虛濕滯證患者中的豐度水平明顯高于對照組，而布魯菌、鞘氨醇單胞菌的豐度水平明顯低于對照組，這表明肺癌的發生發展可能與腸道中某些菌群的增加或者減少有關。

本研究運用代謝組學分析和16SrDNA測序分析對微生物及其代謝物的相互作用進行探究，并通過對差異代謝物與菌群進行網絡調控分析，結果發現瘤胃球菌屬與多種代謝產物（纈氨酸、糞卟啉、膽紅素）具有相關性。纈氨酸的高攝取是腫瘤氨基酸代謝的特點之一，在機體蛋白質合成和分解中發揮重要調節作用。有關證據表明，瘤胃球菌屬在肺癌患者腸道中含量較高[8]。特定的微生物和微生物失活可以通過破壞DNA、激活致癌信號傳導途徑和產生促進腫瘤的代謝物，從而推進相關腫瘤的發展[9-12]。因此,筆者推測瘤胃球菌屬可能通過調控多種代謝途徑影響肺癌的形成。

細胞信號通路失調會引發腫瘤的發生和發展。為了進一步明確信號通路在肺癌發生發展中的作用，本研究在多組學水平上探索了信號通路在NSCLC脾虛濕滯證中的變化，通過KEGG代謝通路富集分析以及關聯數據網絡圖篩選，發現MAPK、PI3K-Akt、Ras信號通路、癌癥信號通路、細胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）5 條信號通路。PI3K-Akt信號通路是公認的癌細胞存活第一信號通路，活化時能夠促進癌細胞增殖、加速細胞周期、促進腫瘤轉移和抑制細胞凋亡[13]。約90%的NSCLC細胞株存在PI3K-Akt信號通路的激活，倪琛琛等[14]檢測了100例NSCLC組織，發現PI3K及Akt蛋白陽性率分別為51%和23%，推測PI3K-Akt信號通路可能與肺癌的發生發展、治療及預后密切相關。MAPK信號通路在許多細胞活動中發揮作用，其亞家族細胞外調節蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號通路在癌細胞增殖、遷移和腫瘤侵襲發生的幾個步驟中起著關鍵作用。Chen等[15]發現，在188例肺腺癌腫瘤標本中，2/3以上至少有一個MAPK通路的基因發生突變，由此表明MAPK在肺癌的發生中可能起著非常重要的作用。綜上所述，筆者推測PI3K-Akt、MAPK通路的失調可能會導致肺癌的發生。

肺癌在中醫學內屬“積聚”“肺積”等范疇，“扶正祛邪”是中醫學的基本治則之一。所謂“正盛邪自祛”，即通過提高正氣的方式驅邪外出；而“邪祛正自安”，即通過消除外邪的方式恢復健康?，F代藥理學研究發現，中醫藥治療可以促進有益菌增殖或抑制病原菌，增加短鏈脂肪酸等代謝產物生成，恢復腸道微生態平衡，發揮治療作用[16]。本課題組前期使用清肺合劑干預肺癌小鼠，發現腸道內有害菌屬另枝菌屬（Alistipes）豐度明顯減低，而益生菌屬嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia）豐度明顯增高[17]。研究證實，嗜黏蛋白阿克曼菌具有改善代謝、調節宿主免疫反應和恢復腸道屏障的功能[18]。進一步研究可以以此為基礎，揭示中藥通過調節腸道微生態從而發揮藥效的確切機制。

眾所周知，脾虛濕滯證是肺癌的常見證候，培土生金方藥治療脾虛濕滯證具有較好療效，本研究通過KEGG富集分析發現NSCLC脾虛濕滯證患者PI3KAkt信號通路發生改變。研究發現，補中益氣湯能夠降低肺癌組織中PI3K-Akt的表達[19]。基于“金土相生”理論，筆者推測脾虛不運、濕邪留滯可能會導致肺組織中PI3K-Akt信號通路變化，從而進一步影響肺癌的發生發展。由此可見，運用中醫理論結合生物標志物深入挖掘中醫治療肺癌的機制具有重要意義，可為臨床治療提供新的靶點。

疾病的發生發展是一個復雜的網絡，腸道微生態、蛋白質、代謝物等與疾病的病理生理機制密切相關。本研究通過多組學聯合分析發現，NSCLC脾虛濕滯證具有特異的腸道菌群、蛋白質和代謝產物，且與腫瘤的發生發展關系密切。多組學聯合分析有助于推動肺癌機制和致病靶點的研究，也能為中醫藥防治肺癌提供理論支持和技術基礎。