海巴戟果實(shí)發(fā)育過程中果糖、果糖激酶及其基因的變化

王青芬, 宮樹森, 白艷, 劉念, 王培源, 吳田

海巴戟果實(shí)發(fā)育過程中果糖、果糖激酶及其基因的變化

王青芬, 宮樹森, 白艷, 劉念, 王培源, 吳田*

(西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，國家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心，云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心，昆明 650224)

為揭示海巴戟果實(shí)風(fēng)味形成機(jī)制，對(duì)果實(shí)發(fā)育過程的果糖激酶(FRK)活性及其基因的表達(dá)模式進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，海巴戟果實(shí)中的果糖、蔗糖、葡萄糖含量隨發(fā)育不斷積累，均在果實(shí)完全成熟時(shí)達(dá)到最高值，而果糖激酶活性隨果實(shí)發(fā)育不斷下降。從果實(shí)中克隆了果糖激酶基因，命名為，GenBank登錄號(hào)為MW380742, 其ORF全長為984 bp，編碼327個(gè)氨基酸，與咖啡()的FRK2氨基酸序列相似性為98%。qRT-PCR表明，的表達(dá)量在果實(shí)發(fā)育過程中呈下降趨勢，當(dāng)果實(shí)成熟時(shí)表達(dá)的趨于平穩(wěn)，與果糖激酶活性變化趨勢一致。因此，可能通過調(diào)控果實(shí)果糖激酶活性而參與糖代謝，對(duì)調(diào)控果實(shí)風(fēng)味的形成具有重要作用。

海巴戟；果糖激酶基因；果糖；表達(dá)

海巴戟()，亦稱諾麗，為茜草科(Rubiaceae)巴戟天屬植物，果實(shí)中含有多種營養(yǎng)成分，如維生素、礦物質(zhì)、氨基酸、塞洛寧原、多糖、香豆素等重要成分。2004年全球諾麗產(chǎn)業(yè)已實(shí)現(xiàn)40億美元的銷售，且呈逐年增加的態(tài)勢，主要用于增強(qiáng)免疫力的保健食品[1]。海巴戟果實(shí)屬于典型的呼吸躍變型，在果實(shí)后熟過程中積累有益于人體健康的營養(yǎng)成分并形成其特有的風(fēng)味，對(duì)果實(shí)成熟品質(zhì)特性和品質(zhì)形成進(jìn)行研究具有重要意義。而果實(shí)風(fēng)味形成的重要決定因素是糖類物質(zhì)代謝，如葡萄糖、果糖、蔗糖等，蔗糖是大多數(shù)植物光合作用的同化產(chǎn)物[2]，在轉(zhuǎn)化酶的作用下分解為果糖和葡萄糖，果糖的進(jìn)一步利用需要被果糖激酶(fruc- tokinase, FRK, EC 2.7.1.4)或者己糖激酶(hexokinase, HK, EC 2.7.1.1)磷酸化，但果糖激酶與果糖的親和力更高，植物中的果糖可能主要被果糖激酶磷酸化[3-5]。同時(shí)FRK調(diào)節(jié)植物的代謝和生長發(fā)育[6], 因此，研究海巴戟FRK及其在果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)情況，有利于了解果糖代謝，為改善果實(shí)風(fēng)味提供理論基礎(chǔ)。

目前，已從多種高等植物中克隆了基因，木薯()中有6個(gè)基因()，其在葉、莖、花和果實(shí)中表達(dá)模式不同[7]。柑橘()有2個(gè)基因(和)，在幼葉或幼果等幼嫩組織中表達(dá),而在成熟的果實(shí)中表達(dá)，F(xiàn)RK活性隨果實(shí)發(fā)育呈下降趨勢，與果實(shí)中果糖的積累有關(guān), 推測FRK活性在柑橘果實(shí)果糖積累中起重要作用[8]。Qin等[9]從枇杷()中克隆了1個(gè)基因，的表達(dá)量和FRK活性在果實(shí)發(fā)育早期高于成熟時(shí)期，與果糖含量變化趨勢相反，表明高FRK活性可能抑制果糖的積累。因此，F(xiàn)RK在植物不同的發(fā)育時(shí)期的表達(dá)具有特異性。

目前對(duì)海巴戟的研究主要集中在化學(xué)成分、生理特征、藥用價(jià)值、種質(zhì)資源、繁殖和加工技術(shù)等方面，對(duì)海巴戟果實(shí)成熟調(diào)控機(jī)理的研究鮮有報(bào)道。本研究以不同發(fā)育時(shí)期海巴戟果實(shí)為材料，因?yàn)楣麑?shí)中糖含量和FRK活性具有一定的關(guān)系，基于前期RNA-seq研究結(jié)果，進(jìn)一步克隆了果糖激酶基因，分析了在海巴戟果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)模式，為后續(xù)深入研究相應(yīng)基因功能和調(diào)控海巴戟果實(shí)品質(zhì)提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

海巴戟()種植于云南省玉溪市元江縣海巴戟種植基地。元江是典型的干熱河谷氣候，年平均為23.7 ℃，年均降水量約800 mm，適合海巴戟的生長發(fā)育[10]。海巴戟果實(shí)發(fā)育分為花脫落期(4成熟)、幼果形成期(5成熟)、膨大期(6成熟)、綠熟期(8成熟)和白熟期(全熟)。采集不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)切碎，迅速用液氮速凍，放于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 果實(shí)糖含量

海巴戟果實(shí)糖含量參照帥良等[11]的方法測定，用高效液相色譜儀(Agilent1260，德國)測定，每個(gè)發(fā)育時(shí)期3個(gè)重復(fù)。所用標(biāo)準(zhǔn)品為果糖、葡萄糖和蔗糖，均為分析純樣品，通過比較樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的峰保留時(shí)間和峰面積，分析糖的種類并計(jì)算含量。

1.3 果實(shí)的果糖激酶活性測定

參照帥良等[11]的方法提取果糖激酶(FRK)，用紫外分光光度計(jì)(UV-5100, 上海)測定FRK活性, 所有操作都在冰上完成，重復(fù)3次。

1.4 McFRK2的表達(dá)分析

基于海巴戟RNA-seq研究，篩選出4個(gè)基因片段，其中基因在采摘后0和48 h表達(dá)量差異顯著，設(shè)計(jì)熒光定量引物qFRK2 (表1)，以為內(nèi)參基因[12]進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20L，包括2×SYBR Green master mix 10L，正、反向引物qFRK2各0.6L，果實(shí)cDNA模板2L，ddH2O 6.8L。qPCR反應(yīng)程序?yàn)橄?5 ℃ 10 min; 然后95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共40個(gè)循環(huán)。3個(gè)重復(fù)，用2-??CT計(jì)算相對(duì)表達(dá)量, 并用SPSS進(jìn)行方差分析，以<0.05表示顯著差異,<0.01表示極顯著差異，用Origin 2019作圖。

1.5 McFRK基因的克隆

采用Trigol試劑盒(鼎國生物科技有限公司，北京)提取海巴戟總RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和核酸檢測儀檢測RNA的質(zhì)量。按照TransScript One- Step gDNA Removal and cDNA Syntjesis SuperMix試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)說明書操作，合成第一鏈cDNA。根據(jù)RNA-seq篩選的果實(shí)基因片段，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物FRK2 (表1)，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，擴(kuò)增基因的全長序列。PCR反應(yīng)體系為 20L,包括ddH2O 13.2L, 10×EasyBuffer 2.5L, dNTPs(2.5 mmol/L) 2L，正、反向引物FRK2各0.5L,cDNA模板1L，DNA polymeRABe 0.3L。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋合?5 ℃ 3 min; 然后95 ℃ 45 s, 58 ℃ 45 s, 72 ℃ 90 s, 共35個(gè)循環(huán); 最后72 ℃7 min。于4 ℃下保存，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后,切膠回收，連接到pMD18-T克隆載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，挑取陽性單菌送至上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測序。

表1 引物序列及PCR程序

1.6 生物信息學(xué)分析

用NCBI-blastx進(jìn)行序列比對(duì)，篩選出相似性較高的氨基酸序列，運(yùn)用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用ORF (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進(jìn)行開放閱讀框比對(duì)并推導(dǎo)氨基酸序列，用NCBI- CD-Search進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。用Cell-PLoc 2.0[13](http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。用TMHMM Server v.2.0[14](http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

2 結(jié)果和分析

2.1 果實(shí)的FRK活性和糖含量變化

從圖1可見，F(xiàn)RK活性隨果實(shí)的發(fā)育而不斷下降，果實(shí)完全成熟時(shí)最低。果實(shí)不同發(fā)育期的果糖、蔗糖和葡萄糖含量變化趨勢相似，即3種糖含量都隨果實(shí)的發(fā)育不斷升高，均在果實(shí)完全成熟時(shí)最高，分別為20.02、8.76和10.01 mg/g。果實(shí)在成熟過程中，果糖含量顯著高于葡萄糖和蔗糖含量，并且與葡萄糖和蔗糖的總量大致相等。以膨大期果實(shí)為分界，從花脫落期到膨大期FRK活性下降速率高于從膨大期到白熟期，果糖、蔗糖、葡萄糖含量從花脫落期到膨大期的上升速率高于從膨大期到白熟期。FRK活性與糖含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明高水平的FRK活性可能會(huì)抑制果實(shí)中糖的積累。

2.2 基于海巴戟轉(zhuǎn)錄組測序的FRK基因克隆

RNA-seq測序可以得到植物特定組織或器官在特定時(shí)期的基因表達(dá)信息，有助于挖掘次生代謝產(chǎn)物合成調(diào)控關(guān)鍵酶基因[15]。經(jīng)RNA-seq[16](PRJNA 503490)分析，F(xiàn)RK參與了果糖和甘露糖代謝(ko- 00051)、淀粉和蔗糖代謝(ko00500)、氨基糖和核苷糖代謝(ko00520)途徑。在ko00051和ko00500途徑中，果糖(d-fructose)在FRK和HK作用下轉(zhuǎn)化為-d-果糖-6P (-d-fructose-6P)，然后進(jìn)入糖酵解或糖異生途徑。在ko00520途徑中，果糖(fructose)在FRK和HK作用下磷酸化為果糖-6P (fructose-6P)，然后進(jìn)入糖酵解和糖異生階段。在這3個(gè)途徑中，我們挖掘到差異表達(dá)的(和)和(和)基因，其中在果實(shí)采摘后0和48 h的表達(dá)差異大(圖2)，F(xiàn)C值達(dá)190.57和35.81，可見該基因?yàn)楹０完麑?shí)果糖磷酸化的關(guān)鍵候選基因, 故選擇該基因進(jìn)行后續(xù)的全長克隆及表達(dá)分析。

圖1 海巴戟果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的糖含量和FRK活性。1: 花脫落期; 2: 幼果形成期; 3: 膨大期; 4: 綠熟期; 5: 白熟期。

2.3 McFRK克隆及McFRK生物信息學(xué)分析

克隆的基因的ORF全長為984 bp，編碼327個(gè)氨基酸。利用NCBI-blastx進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)果該蛋白與咖啡()的FRK2氨基酸序列相似性為98%。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明(圖3)，海巴戟的FRK與茜草科咖啡屬咖啡的FRK2親緣關(guān)系最近。這進(jìn)一步表明海巴戟是基因家族成員，故將該基因命名為, GenBank登錄號(hào)為MW380742。

用NCBI中的CD-Search進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，表明McFRK2具有PfkB家族的高度保守特性，包含3個(gè)底物結(jié)合區(qū)域、6個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)和3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域PLN02323、bac_FRK和RbsK, 推測Mc- FRK2蛋白可能具有保守結(jié)構(gòu)域的功能，屬于果糖激酶，對(duì)果糖具有高度特異性(圖4)。

圖2 RNA-seq篩選的6個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)。1: TRINITY_DN17136_ c0_g1; 2: TRINITY_DN4665_c0_g1; 3: TRINITY_DN18580_c0_g1; 4: TRINITY_DN17192_c0_g1; 5: TRINITY_DN17601_c0_g1; 6: TRINITY_ DN10207_c0_g1。

利用Cell-PLoc 2.0進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果表明McFRK2蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)中。TMHMM Server v.2.0的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，該蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，暗示McFRK2蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)合成并行使功能，屬于非分泌蛋白。

2.4 McFRK2的表達(dá)分析

隨果實(shí)的發(fā)育，表達(dá)量逐漸下降，但在果實(shí)接近完全成熟時(shí)表達(dá)量趨于穩(wěn)定(圖5)。從花脫落期到果實(shí)膨大期，的表達(dá)雖逐漸下降，但維持在相對(duì)較高的水平。白熟期果實(shí)的表達(dá)量最低。

圖3 不同物種間FRK蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 海巴戟McFRK2蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

圖5 海巴戟果實(shí)McFRK2基因的表達(dá)。1: 花脫落期; 2: 幼果形成期; 3: 膨大期; 4: 綠熟期; 5: 白熟期。

3 結(jié)論和討論

果實(shí)的風(fēng)味包括甜味、酸味、香味等，甜味主要與果實(shí)中的可溶性糖有關(guān)，果實(shí)中的可溶性糖主要是果糖、葡萄糖和蔗糖，以果糖最甜，其次是蔗糖、葡萄糖。因此，提高果實(shí)的總糖含量或果糖的累積均可改良果實(shí)風(fēng)味[17]。基因可調(diào)節(jié)果實(shí)生長發(fā)育和可溶性糖含量。果糖是植物細(xì)胞中的主要糖分之一，是蔗糖水解的產(chǎn)物，必須磷酸化后才能進(jìn)入下一步代謝，果糖的磷酸化主要是在FRK的催化作用下進(jìn)行。在海巴戟中成功克隆出1個(gè)果糖激酶基因，經(jīng)過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，與茜草科的咖啡聚在同一支，表明海巴戟基因與同科植物的基因相似度高，進(jìn)化關(guān)系較近。本研究以海巴戟RNA-seq為基礎(chǔ)，分析基因在糖代謝途徑中的作用，有助于我們研究該基因的功能[18]，改善果實(shí)的風(fēng)味。

海巴戟果實(shí)中果糖、蔗糖、葡萄糖含量及FRK活性在果實(shí)發(fā)育初期含量最低，隨著果實(shí)發(fā)育，積累量增加，果實(shí)成熟達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)楣麑?shí)發(fā)育早期需要分解大量蔗糖用于生長，因此早期果實(shí)內(nèi)沒有積累大量果糖[19]；果實(shí)發(fā)育后期，蔗糖大量分解，果糖隨之大量積累[20]，果實(shí)中的果糖含量達(dá)到最高，是蔗糖和葡萄糖含量的總和。基因隨著海巴戟果實(shí)的成熟逐漸下降，這與‘紅顏’草莓(‘Hongyan’)中的基因[21]、枸杞()中的基因[22]和楊梅()中的基因[23]的表達(dá)模式一致。基因?qū)儆谔钦{(diào)節(jié)基因[24]，海巴戟基因的表達(dá)量隨果實(shí)的發(fā)育而下降，推測可能與果實(shí)中含糖量的變化有關(guān)。在海巴戟果實(shí)發(fā)育的后期，糖含量達(dá)最大，但是基因的表達(dá)量最低，因此推測基因的表達(dá)也可能受糖含量的調(diào)控。海巴戟果實(shí)發(fā)育過程中，基因的表達(dá)量與果糖、蔗糖、葡萄糖含量呈負(fù)相關(guān)。對(duì)柑橘()[8]、枇杷()[9]、蘋果()[25]果實(shí)的研究結(jié)果表明，、和基因在果實(shí)中的表達(dá)與果糖的積累呈負(fù)相關(guān)。因此，說明當(dāng)與糖類物質(zhì)分解相關(guān)基因的表達(dá)和活性下降時(shí)，有利于果實(shí)中糖類物質(zhì)的積累，在蘋果中過表達(dá)基因，果糖濃度下降，且同源基因在不同植物中的功能是類似的[25]，進(jìn)一步表明在海巴戟果糖降解過程中發(fā)揮作用。

在柑橘果實(shí)中，糖含量與果實(shí)的口感直接相關(guān)，并且是果實(shí)品質(zhì)和風(fēng)味[26]的重要影響因素。果糖對(duì)果實(shí)的品質(zhì)具有重要的作用，也是枇杷成熟果實(shí)中主要的糖類之一[9]。進(jìn)一步表明糖代謝機(jī)制的研究對(duì)改善果實(shí)風(fēng)味具有重要意義。后續(xù)我們將通過構(gòu)建該基因超量表達(dá)載體，利用課題組前期建立的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系[27-28]進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，以明確該基因在果糖代謝過程中及風(fēng)味形成過程中的功能。

[1] LIU J L, ZHANG R, LIU Y B, et al.Literature research and discussion of Chinese medicinal properties of[J].China J Chin Mat Med, 2020, 45(5): 984-990.doi: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20191230.403.

劉金蓮, 張睿, 劉曄斌, 等.諾麗的文獻(xiàn)研究及中藥藥性理論探討 [J].中國中藥雜志, 2020, 45(5): 984-990.doi: 10.19540/j.cnki.cjcmm.20191230.403.

[2] RUAN Y L.Signaling role of sucrose metabolism in development [J].Mol Plant, 2012, 5(4): 763-765.doi: 10.1093/mp/sss046.

[3] GRANOT D, DAVID-SCHWARTZ R, KELLY G.Hexose kinases and their role in sugar-sensing and plant development [J].Front Plant Sci, 2013, 4: 44.doi: 10.3389/fpls.2013.00044.

[4] GRANOT D, KELLY G, STEIN O, et al.Substantial roles of hexo- kinase and fructokinase in the effects of sugars on plant physiology and development [J].J Exp Bot, 2014, 65(3): 809-819.doi: 10.1093/jxb/ ert400.

[5] RIGGS J W, CAVALES P C, CHAPIRO S M, et al.Identification and biochemical characterization of the fructokinase gene family in[J].BMC Plant Biol, 2017, 17(1): 83.doi: 10.1186/s 12870-017-1031-5.

[6] ROLLAND F, BAENA-GONZALEZ E, SHEEN J.Sugar sensing and signaling in plants: conserved and novel mechanisms [J].Annu Rev Plant Biol, 2006, 57(1): 675-709.doi: 10.1146/annurev.arplant.57.032 905.105441.

[7] YAO Y, GENG M T, WU X H, et al.Identification, expression, and functional analysis of the fructokinase gene family in cassava [J].Int J Mol Sci, 2017, 18(11): 2398.doi: 10.3390/ijms18112398.

[8] QIN Q P, ZHANG S L, CHEN J W, et al.Isolation and expression analysis of fructokinase genes from[J].Acta Bot Sin, 2004, 46 (12): 1408-1415.

[9] QIN Q P, CUI Y Y, ZHANG L L, et al.Isolation and induced expre- ssion of a fructokinase gene from loquat [J].Russ J Plant Physl, 2014, 61(3): 289-297.doi: 10.1134/S1021443714030121.

[10] YANG F C, MAO X Y, LIU J X, et al.Variation of major environ- mental factors (temperature and precipitation) in Yuanjiang Dry-hot Valley and the response of pteridophytes [J].J Trop Subtrop Bot, 2020, 28(6): 537-546.doi: 10.11926/jtsb.4198.

楊逢春, 毛曉葉, 劉景欣, 等.元江干熱河谷主要環(huán)境因子(氣溫和降水)變化規(guī)律及蕨類植物的分布響應(yīng) [J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2020, 28(6): 537-546.doi: 10.11926/jtsb.4198.

[11] SHUAI L, XUE X Q, NIU J J, et al.Analyses of the fructokinase activity and its gene expression during the development of longan fruits [J].J S China Agric Univ, 2015, 36(5): 99-104.doi: 10.7671/j.issn.1001-411X.2015.05.017.

帥良, 薛曉清, 牛佳佳, 等.龍眼果實(shí)發(fā)育過程中果糖激酶活性及其基因表達(dá)分析 [J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 36(5): 99-104.doi: 10.7671/j.issn.1001-411X.2015.05.017.

[12] WU T, LAN Z Q, WANG H F.Cloning and development of real-time fluorescence quantitative PCR assay ofgene fragment from Noni [J].J CS Univ For Technol, 2018, 38(2): 16-22.doi: 10.14067/j.cnki.1673-923x.2018.02.003.

吳田, 藍(lán)增全, 王華芳.諾麗基因片段克隆及實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立 [J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 38(2): 16-22.doi: 10.14067/j.cnki.1673-923x.2018.02.003.

[13] CHOU K C, SHEN H B.Cell-PLoc: A package of Web servers for predicting subcellular localization of proteins in various organisms [J].Nat Protoc, 2008, 3(2): 153-162.doi: 10.1038/nprot.2007.494.

[14] KROGH A, LARSSON B, VON HEIJNE G, et al.Predicting trans- membrane protein topology with a hidden Markov model: Application to complete genomes [J].J Mol Biol, 2001, 305(3): 567-580.doi: 10.1006/jmbi.2000.4315.

[15] LIN J B, WANG W Y, ZOU H, et al.Analysis of related genes in phytosterol biosynthesis inbased on trans- criptome sequencing technology [J].J Trop Subtrop Bot, 2019, 27(6): 693-701.doi: 10.11926/jtsb.4025.

林江波, 王偉英, 鄒暉, 等.基于轉(zhuǎn)錄組測序的鐵皮石斛植物甾醇生物合成相關(guān)基因分析 [J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2019, 27(6): 693-701.doi: 10.11926/jtsb.4025.

[16] HU D Y, ZHANG Z X, LIU J, et al.Expression analysis of ethylene regulates related genes infruit based on transcri- ptome sequencing [J].J Sichuan Agric Univ, 2020, 38(5): 528-537.doi: 10.16036/j.issn.1000-2650.2020.05.004.

胡丹焱, 張正雪, 劉娟, 等.基于轉(zhuǎn)錄組測序的海巴戟果實(shí)中乙烯調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)分析 [J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 38(5): 528- 537.doi: 10.16036/j.issn.1000-2650.2020.05.004.

[17] WANG T L, YE H X, ZHENG J R, et al.Research progress of main flavor compounds in tomato fruits [J].Acta Agric Zhejiang, 2020, 32 (8): 1513-1522.doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2020.08.22.

王同林, 葉紅霞, 鄭積榮, 等.番茄果實(shí)中主要風(fēng)味物質(zhì)研究進(jìn)展 [J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2020, 32(8): 1513-1522.doi: 10.3969/j.issn.1004- 1524.2020.08.22.

[18] HUA W P, ZHANG Y, SONG J, et al.transcriptome sequencing into identify genes involved in the biosynthesis of active ingredients [J].Genomics, 2011, 98(4): 272-279.doi: 10.1016/j.ygeno.2011.03.012.

[19] QI H Y, LI T L, LIU H T, et al.Studies on carbohydrate content and sucrose-metabolizing enzymes activities in different parts of tomato [J].Acta Hort Sin, 2005, 32(2): 239-243.doi: 10.3321/j.issn:0513-353X.2005.02.010.

齊紅巖, 李天來, 劉海濤, 等.番茄不同部位中糖含量和相關(guān)酶活性的研究 [J].園藝學(xué)報(bào), 2005, 32(2): 239-243.doi: 10.3321/j.issn: 0513-353X.2005.02.010.

[20] QIN Q P, ZHANG S L, XIE M, et al.Progress on the research of the molecular regulation of sugar content and composition in fruit [J].J Fruit Sci, 2005, 22(5): 519-525.doi: 10.3969/j.issn.1009-9980.2005.05.019.

秦巧平, 張上隆, 謝鳴, 等.果實(shí)糖含量及成分調(diào)控的分子生物學(xué)研究進(jìn)展 [J].果樹學(xué)報(bào), 2005, 22(5): 519-525.doi: 10.3969/j.issn.1009-9980.2005.05.019.

[21] Lü W Y, ZHANG L Q, GAO Q H, et al.Cloning and expression analysis of fructokinase genefrom ‘Benihoppe’ strawberry [J].Acta Agric Shanghai, 2020, 36(6): 1-5.doi: 10.15955/j.issn1000-3924.2020.06.01.

呂文遠(yuǎn), 張麗勍, 高清華, 等.‘紅顏’草莓中果糖激酶基因的克隆與表達(dá)分析 [J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2020, 36(6): 1-5.doi: 10.15955/j.issn1000-3924.2020.06.01.

[22] ZHAO J H, YIN Y, LI H X, et al.Cloning and expression analysis of fructokinase gene () from wolfberry (Linn.) [J].Acta Bot Boreali-Occid Sin, 2018, 38(5): 816-822.doi: 10.7606/j.issn.1000-4025.2018.05.0816.

趙建華, 尹躍, 李浩霞, 等.枸杞果糖激酶基因的克隆及表達(dá)分析 [J].西北植物學(xué)報(bào), 2018, 38(5): 816-822.doi: 10.7606/j.issn.1000-4025.2018.05.0816.

[23] CHEN X, SHI L Y, SHAO J R, et al.Molecular cloning and expression analysis ofin Chinese bayberry during fruit ripening [J].Acta Hort Sin, 2016, 43(8): 1585-1592.doi: 10.16420/j.issn.0513-353x.2016- 0219.

陳馨, 施麗愉, 邵佳蓉, 等.楊梅果糖激酶基因的克隆及在成熟期果實(shí)中的表達(dá)分析 [J].園藝學(xué)報(bào), 2016, 43(8): 1585-1592.doi: 10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0219.

[24] WANG W P, CUI N, YU Z H, et al.Cloning and expression analysis of fructokinase gene () from tomato fruit [J].Acta Agric Boreali-Sin, 2011, 26(3): 11-15.

王衛(wèi)平, 崔娜, 于志海, 等.番茄果實(shí)果糖激酶基因的克隆及其表達(dá)分析 [J].華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2011, 26(3): 11-15.

[25] LI M J, FENG F J, CHENG L L.Expression patterns of genes involved in sugar metabolism and accumulation during apple fruit development [J].PLoS One, 2012, 7(3): e33055.doi: 10.1371/journal.pone.003 3055.

[26] ZHAO Z Z, ZHANG S L, CHEN J W, et al.The physiological mecha- nism on the difference of sugar accumulation in citrus varieties [J].Sci Agric Sin, 2002, 35(5): 541-545.

趙智中, 張上隆, 陳俊偉, 等.柑橘品種間糖積累差異的生理基礎(chǔ) [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2002, 35(5): 541-545.

[27] LIU J, LAN Z Q, WU T, et al.Transformation of non-seeded gene into noni root segment by[J].Biotechnology, 2018, 28(5): 473-477.doi: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2018.05.0082.

劉娟, 藍(lán)增全, 吳田, 等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的無籽基因轉(zhuǎn)化諾麗根段 [J].生物技術(shù), 2018, 28(5): 473-477.doi: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2018.05.0082.

[28] JIA D D, LAN Z Q, WU T.Studies on genetic transformation of seed- lessness gene to noni () with its stem segments as the explants [J].J SW Univ (Nat Sci), 2018, 40(9): 7-12.doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2018.09.002.

賈丹丹, 藍(lán)增全, 吳田.以諾麗莖段為外植體的無籽基因轉(zhuǎn)化研究 [J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2018, 40(9): 7-12.doi: 10.13718/j.cnki.xdzk.2018.09.002.

Changes in Fructose, Fructokinase and Its Gene induring Fruit Development

WANG Qingfen, GONG Shusen, BAI Yan, LIU Nian, WANG Peiyuan, WU Tian*

(Southwest Landscape Architecture Engineering Technology Research Center of National Forestryand Grassland Administration, Yunnan Functional Flower Resources and Industrialization Technology Engineering Research Center, College of Landscape Architecture and Horticulture Sciences, Southwest Forestry University,Kunming 650224, China)

Toreveal the formation mechanism of fruit flavor in, the activity and expression pattern of fructokinase (FRK) gene during fruit development were studied.The results showed that the contents of fructose, sucrose and glucose in fruit ofaccumulated with the development of fruit, and reached the highest when the fruit was fully mature, while the activity of fructokinase decreased with the development of the fruit.The fructokinase gene, named aswas cloned fromfruit, with 984 bp ORF, encoding 327 amino acids, and the GenBank accession number was MW380742.The amino acid sequence of McFRK2 was similar to that of FRK2 of coffee () at 98%.By using qRT-PCR, the expression ofdecreased gradually during fruit development.When the fruit was ripe, the expression oftended to be stable, which was consistent with the change trend of fructokinase activity.Therefore,might be involved in glucose metabolism by regulating fructokinase activity in fruits, which plays an important role in regulating fruit flavor formation.

; Fructokinase gene; Sugar; Expression

10.11926/jtsb.4405

2021-03-02

2021-05-18

國家林業(yè)和草原局項(xiàng)目([2019]27); 云南省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2019IB011)資助

This work was supported by the Projects of National Forestry and Grassland Administration (Grant No.[2019]27), and the Project for Key Research and Development in Yunnan (Grant No.2019IB011).

王青芬(1996～ )，女，碩士研究生，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail: wangqingfen@swfu.edu.cn

通信作者Corresponding author.E-mail:wutianpotato@swfu.edu.cn