三葉木通藤莖的三萜成分及其抗菌活性研究

賈永霞, 楊秋霞, 曾雷，徐巧林*，劉少博，徐信蘭，譚建文

三葉木通藤莖的三萜成分及其抗菌活性研究

賈永霞1, 楊秋霞1, 曾雷2，徐巧林2*，劉少博3，徐信蘭1，譚建文3

(1.中國科學院華南植物園，廣州 510650；2.廣東省林業科學研究院廣東省森林培育與保護利用重點實驗室，廣州 510520；3.華南農業大學林學與風景園林學院，廣州 510642)

為闡明三葉木通()藤莖的化學成分及其抗菌物質基礎，采用正、反相硅膠柱色譜、凝膠柱色譜及半制備液相色譜等方法對其化學成分進行研究，從其乙醇提取物中得到9個三萜類化合物，根據理化性質和波譜數據，其結構分別鑒定為stachlic acid A (1)，齊墩果酸(2)、烏蘇酸(3)、2,3-dihydroxyolean-13(18)-en-28-oic acid (4)、serratagenic acid (5)、gypsogenic acid (6)、20-hydroxyl-29-noroleanolic acid (7)、mesembryanthemoidigenic acid (8)和12-hydroxy--lactone (9)?？咕钚苑治霰砻?，化合物2和3對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽胞桿菌有顯著的抗菌活性，但對革蘭氏陰性菌鼠傷寒沙門氏菌無明顯抑制作用?；衔?和7為首次從木通屬中分離得到，化合物1、4、6和9為首次從該植物中分離獲得。

三葉木通；藤莖；三萜；抗菌活性

三葉木通()為木通科(Ladizaba- lacene)木通屬多年生落葉木質藤本，根、莖、果實均可入藥，在我國已有上千年的應用歷史，有利尿、通乳、舒筋活絡之功效，用于治療風濕關節痛等癥[1]。三葉木通在我國主產于貴州、重慶、湖北、湖南西部、陜西南部、甘肅東南部至長江流域各省區，生于山谷疏林或丘陵灌叢中，在日本也有零星分布。三葉木通干燥藤莖是我國傳統重要的中藥材，被《中國藥典》等收錄，具有利尿通淋、清心除煩、通經下乳的功效，用于治療淋證、水腫、心煩尿赤、口舌生瘡、經閉乳少、濕熱痹痛等癥[2]。

迄今為止，已從三葉木通的愈傷組織、莖和果皮中分離報道了約80余種化學成分，其中有近70種為三萜或三萜皂苷類化合物[3-9]，顯示三萜類成分為三葉木通重要的功效成分。另外，有研究表明三葉木通中含有苯丙素和咖啡?？崴犷惓煞諿10-11]。為深入研究三葉木通藤莖中的化學成分組成，進一步闡明三葉木通三萜類化學成分，為深入開發利用奠定物質基礎。本研究從三葉木通藤莖的乙醇提取物中分離得到9個三萜化學成分，分別鑒定為stachlic acid A (1)，齊墩果酸(2)、烏蘇酸(3)、2,3-dihy- droxyolean-13(18)-en-28-oic acid (4)、serratagenic acid (5)、gypsogenic acid (6)、20-hydroxyl-29-norolea- nolic acid (7)、mesembryanthemoidigenic acid (8)和12-hydroxy--lactone (9)，其中，化合物3和7為首次從木通屬植物中分離獲得，化合物1、4、6和9為首次從三葉木通藤莖中分離得到。采用刃天青顯色法進行抗菌活性分析，結果表明，化合物2和3對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌()、蠟樣芽孢桿菌()和枯草芽胞桿菌()具有顯著的抗菌活性，但對革蘭氏陰性菌鼠傷寒沙門氏菌()無明顯抑制作用。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司), 中壓反相柱層析HPLC半制備系統(北京創新通恒科技有限公司)，超導核磁共振儀(Bruker DRX-400、Bruker Advance-600，瑞士Bruker公司)，N-1000旋轉蒸發儀(日本東京理化EYELA公司)，粉碎儀(RT- 04，屹立工具有限公司)；電噴霧質譜(MDS SCIEX API，美國應用生物系統公司)，電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

柱層析色譜正相硅膠(80～100、100～200和200～300目, 青島海洋化工廠); 薄層色譜正相硅膠板

HFGF254(山東煙臺江友硅膠開發有限公司)、GF254(青島海洋化工廠)；YMC ODS-A (50m，日本YMC公司)；Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences公司)；氘代試劑(CDCl3、CD3OD、DMSO-6，Sigma公司)；實驗中所用分析純試劑石油醚、乙酸乙酯、甲醇、氯仿(天津市富宇試劑公司)，色譜級甲醇、乙腈(默克股份兩合公司)。紫外熒光(254 nm)、碘蒸氣以及噴灑硫酸-乙醇溶液(20∶80，/)加熱顯色。

1.2 材料

實驗用三葉木通藤莖材料于2009年9月采自湖南省桑植縣，經中國科學院華南植物園羅世孝研究員鑒定為木通科木通屬三葉木通()，標本存放于中國科學院華南植物園生物有機化學實驗室(No.20090921)。

供測試篩選的細菌菌株來自廣東省微生物研究所，包括革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(, CMCC26003)、蠟樣芽孢桿菌(, CMCC63302)、枯草芽胞桿菌(,CMCC63501)和革蘭氏陰性菌鼠傷寒沙門氏菌(,CMCC51252)。

1.3 提取和分離

三葉木通藤莖干品2.0 kg粉碎，經95%乙醇浸泡室溫提取3×24 h，合并提取液；減壓濃縮后加水成混懸液再萃取濃縮，得石油醚萃取部(16.6 g)和乙酸乙酯萃取部(67.8 g)。石油醚萃取部經正相硅膠柱層析(200～300目)，以石油醚-丙酮(100∶1→0∶1,/, 下同)梯度洗脫，檢測合并主點相同的流分, 得到E1～E9共9個組分。組分E3經正相硅膠柱層析(200～ 300目), 以石油醚-丙酮(100∶1→0∶1)梯度洗脫, 檢測合并主點相同的流分，得到E3-1～E3-4共4個組分。E3-3為石油醚-丙酮2∶1洗脫得到的組分，經Sepha- dex LH-20柱層析(流動相為丙酮)，得到亞組分E3-3-1～ E3-3-7，E3-3-6繼續經Sephadex LH-20柱層析(流動相為氯仿-甲醇=1∶4)，得到化合物9 (2 mg) (圖1)。E4經MCI柱脫色，甲醇洗脫物再經正相硅膠柱層析(200～300目)，以石油醚-丙酮(100∶0→10∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→0∶100)梯度洗脫，TLC薄層檢測合并主點相同的流分，得到E4-1～E4-7共7個組分。E4-5經正相硅膠層析柱(200～300目)分離純化,以石油醚-丙酮(10∶1→8∶1→6∶1→0∶100)為流動相梯度洗脫，根據薄層板檢測，收集洗脫液得到5個組分E4-5-1～E4-5-5。E4-5-5經Sephadex LH-20柱(acetone)分離純化，再經反相中壓柱層析以甲醇-水=70∶30→85∶15 (0～60 min), 85∶15→100∶0 (61～220 min)為流動相梯度洗脫, 流速為10 mL/min, 根據薄層板檢測，收集含主點的洗脫液組分，再經Sephadex LH-20柱(氯仿∶甲醇=1∶4)純化，得到化合物2 (3.5 mg)和3 (4.6 mg)。E6經正相硅膠層析柱(200～300目)分離，以氯仿-甲醇= 100∶0、100∶1、100∶3、20∶1、10∶1、0∶100為流動相梯度洗脫，根據薄層板檢測，收集洗脫液，得到6個組份E6-1～ E6-6；E6-6經反相中壓柱層析以甲醇-水=60∶40→ 75∶25 (0～100 min), 75∶25→90∶10 (100～250 min), 90∶10→100∶0 (250～300 min)為流動相梯度洗脫，流速為10 mL/min，根據薄層板檢測, 收集洗脫液，得到的主點組分再經Sepha- dex LH-20柱(流動相：丙酮)分離純化，得到化合物4 (3 mg)。E8經MCI柱，甲醇洗脫后以石油醚-丙酮(100∶1～0∶100)梯度洗脫，根據薄層板檢測，收集洗脫液合并相同主點部分得到8個流份。流份E8-4再經Sephadex LH- 20柱(氯仿-甲醇=1∶4)分離純化, 得到4個組分。組分E8-4-3繼續經反相(C-18)中壓柱層析以甲醇-水= 50∶50→75∶75 (0～100 min), 75∶25→100∶0 (100～ 400 min)為流動相梯度洗脫，流速為10 mL/min，根據薄層板檢測, 洗脫液合并得到10個亞組份。組分E8-4-3-3經凝膠Sephadex LH-20柱(流動相：甲醇)分離純化得到2個主點組分，主點組分2經快速正相硅膠層析柱(200～300目)分離純化，以氯仿-甲醇= 100∶0、99∶1、98∶2、97∶3為流動相梯度洗脫，收集氯仿-甲醇=98∶2洗脫部分經Sephadex LH-20柱(氯仿-甲醇=1∶4分離純化，得到化合物7 (2 mg)。E8-4-3-5經Sephadex LH-20柱(流動相：甲醇)分離得到2個主點組分，主點組分1經Sephadex LH-20柱(流動相：氯仿-甲醇=1∶4)分離純化，得到化合物8 (2.7 mg)；主點組分2經正相硅膠層析柱(200～ 300目)分離純化，以氯仿-甲醇= 100∶0，99∶1，98∶2，97∶3為流動相梯度洗脫，收集氯仿-甲醇= 98∶2洗脫部分，再經Sephadex LH-20柱(氯仿-甲醇=1∶4)分離純化得到化合物5 (2.1 mg)。乙酸乙酯部分(800.0 g)經硅膠柱層析(200～300目)，以氯仿-甲醇(97∶3、90∶10、85∶15、70∶30、60∶40、0∶100)梯度洗脫，經TLC薄層層析檢測合并主點相同的流分，得到F1～F10共10個組分。F5經正相硅膠層析柱(200～300目)分離純化，以氯仿-甲醇(98∶2、95∶5、9∶1, 0∶100)梯度洗脫，TLC薄層檢測合并主點相同的流分，得到7個組分。F5-5經反相中壓柱層析分離, 甲醇-水(50∶50、60∶40、70∶30、80∶20、90∶10、100∶0)為流動相梯度洗脫, 收集70%甲醇-水洗脫流份, 經Sephadex LH-20柱(氯仿-甲醇=1∶4)純化，得到化合物6 (2.2 mg)。F7經反相中壓柱層析分離，甲醇-水為流動相梯度洗脫(20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15、90∶10、100∶0)，根據薄層板檢測, 洗脫液合并得到組分F7-1～ F7-7。F7-7再經Sephadex LH-20柱(甲醇)分離純化，得到化合物1 (6.6 mg)。

圖1 化合物1～9的結構

1.4 結構鑒定

化合物1 白色無定形粉末，ESI-MS:527 [M + Na]+, 503 [M - H]-, 分子量為504。分子式為C30H48O6。1H NMR (600 MHz, C5D5N):5.49 (1H, m, H-12), 1.21 (3H, s, H-30), 1.20 (3H, s, H-27), 1.06 (3H×3, s, H-24, H-25, H-26);13C NMR (150 MHz, C5D5N):47.5 (CH2, C-1), 68.7 (CH, C-2), 78.0 (CH, C-3), 43.4 (C, C-4), 47.8 (CH, C-5), 18.3(CH2, C-6), 32.7 (CH2, C-7), 39.6 (C, C-8), 48.0 (CH, C-9), 38.2 (C, C-10), 23.6 (CH2, C-11), 122.3 (CH, C-12), 144.8(C, C-13), 42.0 (C, C-14), 28.1 (CH2, C-15), 23.8 (CH2, C-16), 46.9 (C, C-17), 41.2 (CH, C-18), 41.1 (CH2, C-19), 36.4 (C, C-20), 28.9 (CH2, C-21), 32.5 (CH2, C-22), 66.3 (CH3, C-23), 14.1 (CH3, C-24), 17.2 (CH3, C-25), 17.3 (CH3, C-26), 26.0 (CH3, C-27), 180.1 (C, C-28), 73.6 (CH2, C-29), 19.5 (CH3, C-30)。以上波譜數據與文獻[12]報道基本一致，故確定該化合物為stachlic acid A。

化合物2 白色無定形粉末；ESI-MS: 479 [M + Na]+, 455 [M ? H]?, 分子式為C30H48O3;1H NMR (600 MHz, C5D5N):5.50 (1H, t,= 3.0 Hz, H-12), 3.31 (1H, dd,= 13.9, 4 .2 Hz, H-18), 3.43 (1H, m, H-3), 1.29 (3H, s), 1.24 (3H, s), 1.01 (3H, s), 1.02 (3H, s), 1.00 (3H, s), 0.95 (3H, s), 0.91 (3H, s);13C NMR (150 MHz, C5D5N):38.9 (CH2, C-1), 28.2 (CH2, C-2), 78.1 (CH, C-3), 39.3 (C, C-4), 55.9 (CH, C-5), 18.8 (CH2, C-6), 33.1 (CH2, C-7), 39.8 (C, C-8), 47.9 (CH, C-9), 37.3 (C, C-10), 23.7 (CH2, C-11), 122.3 (CH, C-12), 144.6 (C, C-13), 42.1 (C, C-14), 28.2 (CH2, C-15), 23.7 (CH2, C-16), 46.6 (C, C-17), 41.9 (CH, C-18), 46.5 (CH2, C-19), 30.9 (C, C-20), 34.2 (CH2, C-21), 33.2 (CH2, C-22), 28.7 (CH3, C-23), 16.4 (CH3, C-24), 15.4 (CH3, C-25), 17.4 (CH3, C-26), 26.1 (CH3, C-27), 180.0 (C, C-28), 33.2 (CH3, C-29), 23.6 (CH3, C-30)。以上波譜數據與文獻[13]報道基本一致，故確定該化合物為齊墩果酸。

化合物3 白色粉末；ESI-MS: 479 [M + Na]+, 455 [M ? H]?, 分子式為C30H48O3;1H NMR (600 MHz, C5D5N):1.24 (3H, s), 1.23 (3H, s), 1.06 (3H, s), 1.03 (3H, d,= 5.5 Hz), 1.01 (3H, s), 0.96 (3H, d,= 6.3 Hz), 0.89 (3H, s), 2.64(1H, d,= 11.4 Hz, H-18), 3.46(1H, m, H-3), 5.48(1H, t,= 3.0 Hz, H-12);13C NMR (150 MHz, C5D5N):39.1 (CH2, C-1), 28.0 (CH2, C-2), 78.1 (CH, C-3), 39.2 (C, C-4), 55.9 (CH, C-5), 18.8 (CH2, C-6), 33.6 (CH2, C-7), 39.9 (C, C-8), 47.9 (CH, C-9), 37.4 (C, C-10), 23.6 (CH2, C-11), 125.6 (CH, C-12), 139.3 (C, C-13), 42.5 (C, C-14), 28.6 (CH2, C-15), 24.8 (CH2, C-16), 48.1 (C, C-17), 53.5 (CH, C-18), 39.5 (CH, C-19), 39.3 (CH, C-20), 31.0 (CH2, C-21), 37.3 (CH2, C-22), 28.7 (CH3, C-23), 16.4 (CH3, C-24), 15.7 (CH3, C-25), 17.3 (CH3, C-26), 23.6 (CH3, C-27), 179.9 (C, C-28), 21.4 (CH3, C-29), 17.4 (CH3, C-30)。以上波譜數據與文獻[13]報道基本一致，故確定該化合物為烏蘇酸。

化合物4 白色無定形粉末；ESI-MS: 495[M + Na]+, 471[M ? H]-, 943[2M ? H]-, 967[2M +Na]+, 分子式為C30H48O4;1H NMR (600 MHz, C5D5N):1.30 (3H, s, H-23), 1.25 (3H, s, H-27), 1.17 (3H, s, H-26), 1.09 (3H, s, H-24), 1.01 (3H, s, H-25), 0.97 (3H,s, H-29), 0.86 (3H, s, H-30);13C NMR (150 MHz, C5D5N):48.0 (CH2, C-1), 68.7 (CH, C-2), 83.7 (CH, C-3), 39.7(C, C-4), 55.9 (CH, C-5), 19.7 (CH2, C-6), 35.3 (CH2, C-7), 42.6 (C, C-8), 51.1 (CH, C-9), 38.7 (C, C- 10), 22.1 (CH2, C-11), 25.4 (CH2, C-12), 137.7 (C, C- 13), 44.7 (C, C-14), 27.6 (CH2, C-15), 33.5 (CH2, C- 16), 48.7 (C, C-17), 129.2 (C, C-18), 41.4 (CH2, C-19), 32.8 (C, C-20), 37.3 (CH2, C-21), 36.4 (CH2, C-22), 29.2 (CH3, C-23), 17.5 (CH3, C-24), 17.8 (CH3, C-25), 18.1 (CH3, C-26), 21.1 (CH3, C-27), 178.9 (C, C-28), 32.2 (C, C-29), 24.3 (CH3, C-30)。以上波譜數據與文獻[14]報道基本一致, 故確定該化合物為2,3-di- hydroxyolean-13(18)-en-28-oic acid。

化合物5 白色無定形粉末；ESI-MS: 509 [M + Na]+, 485 [M ? H]-, 分子式為C30H46O5;1H NMR (600 MHz, CD3OD):5.29 (1H, m, H-12), 3.16 (1H, m), 1.25 (3H, s), 1.17 (3H, s), 1.16 (3H, s), 0.98 (3H, s), 0.95 (3H, s), 0.82 (3H, s), 0.78 (3H, s);13C NMR (150 MHz, CD3OD):38.1 (CH2, C-1), 27.8 (CH2, C-2), 79.7 (CH, C-3), 39.8 (C, C-4), 56.7 (CH, C-5), 19.5 (CH2, C-6), 32.7 (CH2, C-7), 39.8 (C, C-8), 47.4 (CH, C-9), 38.1 (C, C-10), 24.1 (CH2, C-11), 124.4 (CH, C-12), 144.5 (C, C-13), 41.6 (C, C-14), 28.7 (CH2, C-15), 24.5 (CH2, C-16), 46.8 (C, C-17), 41.2 (CH, C-18), 40.5 (CH2, C-19), 42.8 (C, C-20), 29.5 (CH2, C-21), 34.0 (CH2, C-22), 28.7 (CH3, C-23), 16.3 (CH3, C-24), 15.9 (CH3, C-25), 17.7 (CH3, C-26), 26.3 (CH3, C-27), 181.3 (C, C-28), 181.9 (C, C-29), 19.7 (CH3, C-30)。以上波譜數據與文獻[15]報道基本一致，故確定該化合物為serratagenic acid。

化合物6 白色無定形粉末；ESI-MS: 509 [M + Na]+, 485 [M ? H]?, 分子式為C30H46O5;1H NMR (600 MHz, C5D5N):5.49 (1H, m, H-12), 3.42 (1H, m), 1.44 (3H, s), 1.29 (3H, s), 1.04 (3H, s), 1.02 (3H, s), 0.95 (3H, s), 1.01 (3H, s), 0.96 (3H, s);13C NMR (150 MHz, C5D5N):37.6 (CH2, C-1), 26.2 (CH2, C-2), 74.0 (CH, C-3), 53.0 (C, C-4), 50.5 (CH, C-5), 20.2 (CH2, C-6), 31.6 (CH2, C-7), 38.6 (C, C-8), 46.0 (CH, C-9), 35.3 (C, C-10), 22.3 (CH2, C-11), 122.4 (CH, C-12), 143.3 (C, C-13), 40.7 (C, C-14), 26.8 (CH2, C-15), 22.2 (CH2, C-16), 45.1 (C, C-17), 40.5 (CH, C-18), 45.0 (CH2, C-19), 29.5 (C, C-20), 32.7 (CH2, C-21), 31.5 (CH2, C-22), 179.5 (C, C-23), 10.7 (CH3, C-24), 14.5 (CH3, C-25), 15.9 (CH3, C-26), 24.7 (CH3, C-27), 178.7 (C, C-28), 31.8 (CH3, C-29), 22.3 (CH3, C-30)。以上波譜數據與文獻[16]報道基本一致，故確定該化合物為gypsogenic acid。

化合物7 白色粉末；ESI-MS: 481 [M + Na]+, 457 [M ? H]-, 分子式為C29H46O4；1H NMR (600 MHz, C5D5N):5.57 (1H, br.s), 3.37 (1H, dd,= 14.0, 3.8 Hz), 1.59 (3H, s),1.27 (3H, s), 1.25 (3H, s), 1.04 (3H, s), 1.03 (3H, s), 0.90 (3H, s);13C NMR (150 MHz, C5D5N):38.8 (CH2, C-1), 28.7 (CH2, C-2), 78.0 (CH, C-3), 39.6 (C, C-4), 55.7 (CH, C-5), 18.7 (CH2, C-6), 33.2 (CH3, C-7), 39.3 (C, C-8), 48.0 (CH, C-9), 37.2 (C, C-10), 23.6 (CH2, C-11), 122.6 (CH, C-12), 144.2 (C, C-13), 42.0 (C, C-14), 28.2 (CH2, C-15), 23.7 (CH2, C-16), 46.6 (C, C-17), 48.0 (CH, C-18), 49.6 (CH2, C-19), 69.8 (C, C-20), 36.1 (CH2, C-21), 35.0 (CH2, C-22), 28.0 (CH3, C-23), 16.4 (CH3, C-24), 15.4 (CH3, C-25), 17.3 (CH3, C-26), 25.9 (CH3, C-27), 179.9 (C, C-28), 25.5 (CH3, C-29)。以上波譜數據與文獻[15]報道基本一致，故確定該化合物為20-hydroxyl-29-noroleanolic acid。

化合物8 白色無定形粉末；ESI-MS: 495 [M + Na]+, 471 [M ? H]?, 分子式為C30H48O4;1H NMR (600 MHz, CD3OD):5.25 (1H, m, H-12), 0.77 (3H, s), 0.81 (3H, s), 0.92 (3H, s), 0.94 (3H, s), 0.96 (3H, s), 1.17 (3H, s);13C NMR (150 MHz, CD3OD):38.2 (CH2, C-1), 27.9 (CH2, C-2), 79.7 (CH, C-3), 39.8 (C, C-4), 56.7 (CH, C-5), 19.5 (CH2, C-6), 34.0 (CH2, C-7), 39.8 (C, C-8), 49.0 (CH, C-9), 36.9 (C, C-10), 24.0 (CH2, C-11), 123.7 (CH, C-12), 145.2 (C, C-13), 41.9 (C, C-14), 28.7 (CH2, C-15), 24.5 (CH2, C-16), 47.9 (C, C-17), 41.4 (CH, C-18), 40.6 (CH2, C-19), 36.8 (C, C-20), 29.3 (CH2, C-21), 33.1 (CH3, C-22), 28.8 (CH2, C-23), 16.3 (CH3, C-24), 15.9 (CH3, C-25), 17.7 (CH3, C-26), 26.4 (CH3, C-27), 181.7 (C, C-28), 74.4 (CH2, C-29), 19.5 (CH3, C-30)。以上波譜數據與文獻[17]報道基本一致，故確定該化合物為mesembryanthemoidigenic acid。

化合物9 白色無定形粉末；ESI-MS/: 537 [M + Na]+, 513 [M ? H]?, 分子式為C32H50O5;1H NMR (600 MHz, CDCl3):0.86 (3H, s, H-25), 0.88 (3H, s, H-23), 0.91 (3H, s,H-30), 0.91 (3H, s, H-24), 0.99 (3H, s, H-29), 1.15 (3H, s, H-26), 1.31 (3H, s,H-27), 2.06(3H, s, CH3COO), 3.89 (1H, m, H-12), 4.50 (1H, dd,= 11.5, 5.5 Hz, H-3);13C NMR (150 MHz, CDCl3):38.8 (CH2, C-1), 23.8 (CH2, C-2), 81.0 (CH, C-3), 38.1 (C, C-4), 55.5 (CH,C-5), 17.9 (CH2, C-6), 34.2 (CH2, C-7), 42.6 (C, C-8), 44.7 (CH, C-9), 36.6 (C, C-10), 29.1 (CH2, C-11), 76.3 (CH, C-12), 90.8 (C, C-13), 42.3 (C, C-14), 28.2 (CH2, C-15), 21.5 (CH2, C-16), 44.9 (C, C-17), 51.4 (CH, C-18), 39.6 (CH2, C-19), 31.8 (C, C-20), 34.4 (CH2, C-21), 28.3 (CH2, C-22), 27.7 (CH2, C-23), 16.7 (CH3, C-24), 16.6 (CH3, C-25), 18.8 (CH3, C-26), 18.8 (CH3, C-27), 180.1 (C, C-28), 33.5 (CH3, C-29), 24.1 (CH3, C-30), 171.2 (C, C-1′), 21.4 (CH3, C-2′)。以上波譜數據與文獻[18]報道基本一致，故確定該化合物為12-hydroxy--lactone。

1.5 抗菌活性

采用刃天青顯色法[18]分析化合物1～9的抗菌活性，每處理重復3次，以硫酸卡那霉素作為陽性對照，測定化合物的最低抑菌濃度(MIC)。先將100L 100g/mL的指示劑溶液(刃天青)放置到無菌的96孔板上的第11列板孔，約7.5 mL的指示劑溶液與5 mL的待測菌溶液(106CFU/mL)混合，接著轉移100L到第1至第10列以及第12列所有測試孔中，待測樣品(0.8 mg/mL)溶液(100L)加入到第1列板孔中，再從第1列取出100L的溶液轉移到第2列，用同樣的方法(倍增稀釋)轉移到第3～10列，再從第10列取出100L以保證每列孔中的溶液均為100L。最后，將加好樣品的孔板放入到恒溫培養箱，37 ℃培養5～6 h，直到孔板的溶液變成粉紅色。若顏色無變化仍為藍色表示有活性，顏色從藍色變為粉紅色，表示無抑菌活性；顏色變化的最低稀釋濃度則是待測化合物的最低抑菌濃度(MIC)。1個96孔板可同時測定6個樣品、1個陽性對照和1個陰性對照。供測試篩選的細菌菌株包括革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(CMCC26003)、蠟樣芽孢桿菌(CMCC63302)、枯草芽胞桿菌(CMCC63501)和革蘭氏陰性菌鼠傷寒沙門氏菌(CMCC51252)。

結果表明(表1)，化合物2和3具有與陽性對照硫酸卡那霉素接近或相當的體外抑制3種革蘭氏陽性菌的活性，化合物4僅有較弱的抑菌活性(MIC≥ 25g/mL)，而其他化合物則無明顯的抗菌活性(MIC>100g/mL)。

表1 化合物1～9對4種細菌的最小抑菌濃度(MIC, μg/mL)

2 結果和討論

本研究對三葉木通藤莖的化學成分進行了系統分析，從其乙醇提取物中分離得到9個三萜類化合物，經波譜數據分析和文獻比對，分別鑒定為: stachlic acid A (1)，齊墩果酸 (2)，烏蘇酸 (3)，2,3- dihydroxyolean-13(18)-en-28-oic acid (4)，serratagenic acid (5)，gypsogenic acid (6)，20-hydroxyl-29-norolea- nolic acid (7)，mesembryanthemoidigenic acid (8)和12- hydroxy--lactone (9)。化合物3和7為首次從木通屬中分離得到，化合物1、4、6和9為首次從三葉木通中分離獲得。

抗菌活性測試結果表明，化合物2和3對3種革蘭氏陽性菌，即金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽胞桿菌，都有顯著的抑制作用，最低抑菌濃度(MIC)為3.125～6.25g/mL，與陽性對照硫酸卡那霉素接近或相當，化合物4對蠟樣芽孢桿菌有弱的抗菌活性(MIC=25.0g/mL)。所有化合物對革蘭氏陰性菌鼠傷寒沙門氏菌菌株均無顯著抑制作用。這表明化合物2和3是三葉木通藤莖中具有強抑制革蘭氏陽性菌的三萜化合物，對于促進三葉木通植物的綜合開發利用具有積極意義，可望具有潛在重要的價值用途。

三葉木通具有較強的生態適應能力，不僅在我國有廣闊的自然地域分布，并且還呈現出了豐富的品系形態多樣性和地域差異性特征[19]。目前雖然已從三葉木通植物中分離出幾十個化學成分[20]，但具體研究的還僅僅是少數品系，未來有必要推進針對三葉木通不同地域具有差異性特征品系在成分和功能層面的比較分析研究。

[1] ZHOU L, LI C, CAO F J, et al.Anti-cancer Chinese medicine, Akebiae fructus or Yanfu: The historical nomenclature and the distribution across China [J].Clinic J Trad Chin Med, 2019, 31(5): 799-803.doi: 10.16448/j.cjtcm.2019.0235.

周莉, 李琛, 曹風軍, 等.抗癌中藥預知子/燕覆: 本草變遷與資源分布 [J].中醫藥臨床雜志, 2019, 31(5): 799-803.doi: 10.16448/j.cjtcm.2019.0235.

[2] Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, Part 1 [M].Beijing: China Medical Science Press, 2020: 65.

國家藥典委員會.中華人民共和國藥典, 一部[M].北京: 中國醫藥科技出版社, 2020: 65.

[3] GUAN S G, YU W B, GUAN S H.Phenolics and phenolic glycosides from the stems of[J].Lishizhen MedMat Med Res, 2010, 21(4): 905-906.doi: 10.3969/j.issn.1008-0805.2010.04.066.

關樹光, 於文博, 關樹宏.三葉木通中酚醇及酚醇苷類化學成分的研究 [J].時珍國醫國藥, 2010, 21(4): 905-906.doi: 10.3969/j.issn.1008-0805.2010.04.066.

[4] GUAN S H, XIA J M, LU Z Q, et al.Structure elucidation and NMR spectral assignments of three new lignan glycosides from[J].Magn Reson Chem, 2008, 46(2): 186-190.doi: 10.1002/mrc.2152.

[5] WANG Y, NU J, LIN R C.Chemical constituents from the stems of[J].Chin Tradit Herbal Drugs, 2004, 35(5): 495-498.doi: 10.3321/j.issn:0253-2670.2004.05.007.

王曄, 魯靜, 林瑞超.三葉木通藤莖的化學成分研究 [J].中草藥, 2004, 35(5): 495-498.doi: 10.3321/j.issn:0253-2670.2004.05.007.

[6] MIMAKI Y, KURODA M, YOKOSUKA A, et al.Triterpenes and triterpene saponins from the stems of[J].Chem Pharm Bull, 2003, 51(8): 960-965.doi: 10.1248/cpb.51.960.

[7] IWANAGA S, WARASHINA T, MIYASE T.Triterpene saponins from the pericarps of[J].Chem Pharm Bull, 2012, 60(10): 1264-1274.doi: 10.1248/cpb.c12-00448.

[8] WANG J, XU Q L, ZHENG M F, et al.Bioactive 30-noroleanane triterpenes from the pericarps of[J].Molecules, 2014, 19(4): 4301?4312.doi: 10.3390/molecules19044301.

[9] WANG J, REN H, XU Q L, et al.Antibacterial oleanane-type triter- penoids from pericarps of[J].Food Chem, 2015, 168: 623-629.doi: 10.1016/j.foodchem.2014.07.105.

[10] WANG J, ZHOU Z Y, XU Q L, et al.Phenylpropanoids from the stems of[J]J Trop Subtrop Bot, 2014, 22(5): 511-515.doi: 10.3969/j.issn.1005-3395.2014.05.014.

王晶, 周忠玉, 徐巧林, 等.三葉木通莖中的苯丙素類化學成分 [J].熱帶亞熱帶植物學報, 2014, 22(5): 511-515.doi: 10.3969/j.issn.1005- 3395.2014.05.014.

[11] WANG J, XU Q L, ZHOU Z Y, et al.Caffeoylquinic acid derivatives from stems of[J].J Chin Med Mat, 2014, 37(7): 1190-1193.doi: 10.13863/j.issn1001-4454.2014.07.022.

王晶, 徐巧林, 周忠玉, 等.三葉木通藤莖的咖啡?？崴犷惢瘜W成分研究 [J].中藥材, 2014, 37(7): 1190-1193.doi: 10.13863/j.issn 1001-4454.2014.07.022.

[12] YANG J H, WANG Y S, HUANG R, et al.New polyoxygenated triterpenoids fromvar.[J].Helv Chim Acta, 2006, 89(11): 2830-2835.doi: 10.1002/hlca.200690254.

[13] GUO Q L, YANG J S.Studies on chemical constituents in fruit of[J].China J Chin Mater Med, 2005, 30(3): 198?200.

郭啟雷, 楊峻山.掌葉覆盆子的化學成分研究[J].中國中藥雜志, 2005, 30(3): 198?200.

[14] ZENG N, SHEN Y, LI L Z, et al.Anti-inflammatory triterpenes from the leaves of[J].J Nat Prod, 2011, 74(4): 732?738.doi: 10.1021/np1007922.

[15] CHEN G.Studies of the constituents ofwight and[D].Shenyang: Shenyang Pharmaceutical University, 2009: 144?145.

陳剛.昆明杯冠藤和的化學成分研究[D].沈陽: 沈陽藥科大學, 2009: 144?145.

[16] YAMAHARA J, HIDAKA K, ITO M, et al.A triterpene and saponin from roots of[J]1987,-

[17] GUO F J, LIN S, LI Y C.Isolation and identification of triterpenoids from[J].Chin J Med Chem, 2005, 15(5): 294? 296.doi: 10.3969/j.issn.1005-0108.2005.05.011.

郭夫江, 林綏, 李援朝.鵝掌藤中三萜類化合物的分離與鑒定[J].中國藥物化學雜志, 2005, 15(5): 294?296.doi: 10.3969/j.issn.1005- 0108.2005.05.011.

[18] HICHRI F, JANNET H B, CHERIAA J, et al.Antibacterial activities of a few prepared derivatives of oleanolic acid and of other natural triter- penic compounds [J].CR Chim, 2003, 6(4): 473-483.doi: 10.1016/ S1631-0748(03)00066-3.

[19] LI L, YAO X H, ZHONG C H, et al.: A potential new fruit crop in China [J].HortSciene, 2010, 45(1): 4?10.doi: 10.21273/HORTSCI.45.1.4.

[20] LIU Y C, LI H L, ZENG X H, et al.Research progress on chemical components and pharmacological effects of(Thunb.) Koidz.stem [J].Acta Univ Trad Med Sin Pharmacol Shanghai, 2020, 34(3): 99-106.doi: 10.16306/j.1008-861x.2020.03.017.

柳岳超, 李洪亮, 曾小華, 等.三葉木通藤莖的化學成分和藥理作用研究進展 [J].上海中醫藥大學學報, 2020, 34(3): 99-106.doi: 10.16306/j.1008-861x.2020.03.017.

Triterpenes from Stems ofand Their Antibacterial Activities

JIA Yongxia1, YANG Qiuxia1, ZENG Lei2, XU Qiaolin2*, LIU Shaobo3, XU Xinlan1, TAN Jianwen3

(1.South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China; 2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Silviculture, Protection and Utilization, Guangdong Academy of Forestry, Guangzhou 510520, China; 3.College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

To study triterpenes fromand its antibacterial activities, nine triterpenes were isolated from the ethanol extract by various methods, such as silica gel, ODS, Sephadex LH-20 column chromatography and semi-preparative HPLC.Based on physical and chemical properties and spectral data, their structures were identified as stachlic acid A (1), oleanolic acid (2), ursolic acid (3), 2,3-dihydroxyolean-13(18)-en-28-oic acid (4), serratagenic acid (5), gypsogenic acid (6), 20-hydroxyl-29-noroleanolic acid (7), mesembryanthemoidigenic acid (8) and 12-hydroxy--lactone (9).The compounds 2 and 3 had strong antibacterial activity against three tested bacterial strains.Compounds 1, 4, 6 and 9 were isolated fromfor the first time,compounds 3 and 7were isolated from genusfor the first time.

; Stem;Triterpenoid; Antibacterial activity

10.11926/jtsb.4489

2021-07-29

2021-10-09

國家自然科學基金項目(31470422, 31500291), 廣東省林業科技創新項目(2020KJCX013), 廣東省自然科學基金項目(2019A1515011236)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No.31470422, 31500291), the Project for Forestry Science and Technology Innovation in Guangdong (Grant No.2020KJCX013), and the Project for Natural Science in Guangdong (Grant No.2019A1515011236).

賈永霞，女，高級工程師，研究方向為中藥藥效物質基礎研究與質譜技術方法開發。E-mail: jyx@scbg.ac.cn

通信作者Corresponding author.E-mail:qlxu@sinogaf.cn