炮制前后王不留行中3種黃酮苷在大鼠體內藥動學的變化

于現闊， 吳宏偉， 羅寒燕， 張 曉， 魯亞奇， 唐力英， 王祝舉

(中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700)

王不留行始載于《神農本草經》，來源于石竹科植物麥藍菜VaccariasegetalisCarcke的干燥成熟種子[1]，其外觀呈黑色圓球狀，質硬，難破碎，臨床應用時要求“炒制”，現行《中國藥典》及地方炮制規范均要求炒至大部分爆花。炒王不留行最早見于《外科正宗》[2]，沿用至今，并成為唯一炮制方法。傳統炮制理論認為，王不留行生品長于消癰腫，炒后性偏走散，長于活血通經、下乳、利尿通淋[3]，主要含有三萜皂苷、黃酮以及環肽[4]。

Qi等[5-6]灌胃給予大鼠王不留行提取物后發現，在血漿中能檢測到黃酮及三萜皂苷。王不留行黃酮苷[7]是最主要的特征性黃酮，具有保護過氧化氫誘導血管內皮細胞損傷[8]、抑制高糖引起血管內皮細胞凋亡[9]及鈦引起骨質溶解[10]等藥理作用。王不留行炒制后，可提高其水浸出物及總黃酮含量[11-12]，升高黃酮類、刺桐堿、環肽等成分的水煎出率[13-14]，其原理可能是通過增加有效成分的溶出以增強療效，但僅從含量變化上分析[15-16]尚不充分。因此，本實驗在前期成分分離及分析的基礎上，建立UPLC-MS/MS法比較炮制前后王不留行主要成分藥動學變化，探索其在大鼠體內的吸收代謝規律，以期為闡釋該藥材炮制原理提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AXR高效液相色譜儀(日本 Shimadzu公司)；串聯三重四極桿質譜儀Qtrap5500、Analyst 1.6.2質譜數據采集軟件(美國 AB Sciex公司)；Minispin離心機、真空離心濃縮儀、Mikro 220R臺式高速冷凍離心機、移液槍(德國 Eppendorf 公司)；Mix 3000振蕩混勻儀(杭州米歐儀器有限公司)；XS105DU電子分析天平(十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 試劑與藥物 王不留行(批號HBAG2014)收集于河北省安國市藥材市場，經中國中醫科學院中藥所王祝舉研究員鑒定為麥藍菜VaccariasegetalisCarcke的干燥成熟種子。按照2020年版《中國藥典》一部清炒法(通則0213)制備炮制品[1]，具體方法為取生品200 g，待鍋底溫度升至270 ℃后倒入鍋中，炒至大多數爆花，炒制時間約為2 min。王不留行黃酮苷、肥皂草苷、異牡荊素-2″-O-阿拉伯糖苷為本實驗室分離，結構經核磁波譜鑒定，HPLC法檢測純度均大于98%；內標蒙花苷(批號AF7031520)購于成都埃法生物科技有限公司，純度大于98%。乙腈、甲醇、甲酸(美國Fisher 公司)均為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

1.3 動物 雄性SD大鼠12只(SPF級)，體質量為240～260 g，由斯貝福(北京)生物科技有限公司提供，動物生產許可證號SCXK(京)2016-0002。大鼠在標準環境下[溫度(23±1)℃，相對濕度(55±5)%]適應性喂養3 d，給藥前12 h 禁食，自由飲水。動物實驗均符合中國中醫科學院中藥研究所倫理委員會相關規定。

2 方法與結果

2.1 提取物制備 取生品、炮制品粉末(過3號篩)各100 g，置于圓底燒瓶中，加入70%甲醇1 000 mL，加熱回流1 h后提取2次，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑，浸膏加適量水溶解定容至40 mL，生藥量2.5 g/mL，冷藏保存。HPLC法[5]測得生品中王不留行黃酮苷、肥皂草苷、異牡荊素-2″-O-阿拉伯糖苷含量分別為0.41%、0.02%、0.03%，而炮制品中分別為0.36%、0.02%、0.07%。

2.2 對照品、內標溶液及質量控制(QC)樣品制備 精密稱取王不留行黃酮苷、肥皂草苷、異牡荊素-2″-O-阿拉伯糖苷對照品適量，甲醇溶解定容，再按一定倍數稀釋，即得不同質量濃度的對照品溶液。精密稱取內標(蒙花苷)適量，甲醇溶解定容，即得內標溶液(1 mg/L)。取低、中、高質量濃度對照品溶液，真空濃縮，揮干溶劑，加入適量空白血漿混勻，即得QC樣品，在-20 ℃下冷凍保存。

2.3 分析條件

2.3.1 色譜 Waters ACQUITY HSS T3色譜柱 (2.1 mm×100 mm, 1.8 μm)；流動相乙腈(A)-水(含0.1%甲酸)(B)，梯度洗脫(0～1 min, 0～10%A; 1～2 min, 10%～20%A; 2～10 min, 20%～30%A; 10～10.5 min, 30%～80%A; 10.5～11 min, 80%～100%A; 11～11.1 min, 100%～10%A; 11.1～13 min, 10%A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

2.3.2 質譜 電噴霧離子源(ESI)；噴霧電壓5 500 V；霧化溫度 580 ℃；氣簾氣30 psi(1 psi=0.133 kPa)；霧化氣55 psi，輔助氣60 psi；正離子模式檢測，多反應監測(MRM)；王不留行黃酮苷m/z727.2～313.1(45 V)，異牡荊素-2″-O-阿拉伯糖苷m/z565.1～283.1(46 V)，肥皂草苷m/z595.1～415.1(25 V)，內標m/z593.2～447.1(25 V)。

2.4 給藥及采血 12只大鼠隨機分為生品組、炮制品組，每組6只，給藥前禁食12 h不禁水，灌胃給予王不留行提取物(0.01 mL/g)，于給藥前及給藥后5、10、20、30、45 min及1、2、4、8、12、24 h眼底靜脈叢取血各0.3 mL，置于1.5 mL肝素鈉EP管中，3 000 r/min離心10 min，取上層血漿，在 -20 ℃下冷凍保存。

2.5 樣品處理 取“2.4”項下血漿樣品100 μL，置于1.5 mL離心管中，加入5 μL內標溶液(2.51 mg/L)、甲醇300 μL，渦旋振搖10 min，混勻，13 200 r/min冷凍離心10 min，取上清液100 μL，置于250 μL內插管的樣品瓶中，進樣5 μL分析。

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性考察 取空白血漿6份，每份100 μL，按“2.5”項下方法處理，其中內標用等體積甲醇代替，在“2.3”項條件下進樣測定，另取中質量濃度QC樣品及給藥后20 min樣品，同法處理，結果見圖1。由此可知，王不留行黃酮苷、異牡荊素-2″-O-阿拉伯糖苷、肥皂草苷、內標保留時間分別為4.19、4.84、4.36、10.35 min，各黃酮苷峰形較好，出峰時間無干擾，也無血漿內源性物質等其他成分的影響。

2.6.2 線性關系考察 取“2.2”項下對照品溶液100 μL，置于1.5 mL離心管中，真空離心，揮干溶劑，加入100 μL空白血漿混勻，按“2.5”項下方法處理，在“2.3”項條件下進樣測定。以各黃酮苷質量濃度為橫坐標(X)，各黃酮苷、內標峰面積比值為縱坐標(Y)進行回歸，得到方程分別為王不留行黃酮苷Y=0.001 65X+0.010 4(r=0.998 9)，線性范圍10.5～2 100 μg/L，定量限10.5 μg/L；異牡荊素-2″-O-阿拉伯糖苷Y=0.001 92X+0.012 7(r=0.999 1)，線性范圍9.90～1 980 μg/L，定量限9.90 μg/L；肥皂草苷Y=0.001 98X+0.011 4(r=0.999 1)，線性范圍1～200 μg/L，定量限1 μg/L。

2.6.3 準確度、精密度試驗 取3個質量濃度QC樣品6份，每份100 μL，按“2.5”項下方法處理，在“2.3”項條件下進樣測定，以所測質量濃度與實際質量濃度的比值計算日內精密度、準確度，再連續3 d檢測以計算日間精密度，結果見表1，可知各黃酮苷準確度、精密度均符合相關方法學要求。

表1 各黃酮苷準確度、精密度試驗結果 (n=6)

2.6.4 提取回收率、基質效應試驗 取不同質量濃度QC樣品各6份，每份100 μL，按“2.5”項下方法處理，在“2.3”項條件下進樣測定，計算峰面積S1；取空白血漿適量，按“2.5”項下方法處理，上清液中加入不同質量濃度對照品溶液，在“2.3”項條件下進樣測定，計算峰面積S2；取不同濃度對照品溶液，加入內標溶液，在“2.3”項條件下進樣測定，計算峰面積S3，測定提取回收率、基質效應，公式分別為提取回收率=(S1/S2)×100%、基質效應=(S2/S3)×100%，結果見表2，可知該方法不存在明顯的基質效應。

表2 各黃酮苷提取回收率及基質效應試驗結果 (n=6)

2.6.5 穩定性試驗 取3個質量濃度QC樣品各6份，每份100 μL，置于1.5 mL離心管中，分別在室溫下放置4 h、樣品盤中放置24 h、-20 ℃下放置1周、-20 ℃下反復凍融3次，按“2.5”項下方法處理，在“2.3”項條件下進樣測定，計算準確度，結果見表3，可知在不同條件下各黃酮苷穩定性均良好。

表3 各黃酮苷穩定性試驗結果(n=6)

2.7 藥動學研究 對生品組、炮制品組不同時間點的血漿樣品進行蛋白沉淀后，采用UPLC-MS/MS法測定王不留行黃酮苷、異牡荊素-2″-O-阿拉伯糖苷、肥皂草苷血藥濃度，DAS 3.2.6藥動學軟件中的非房室模型計算藥動學參數，SPSS 23.0軟件進行獨立樣本t檢驗，結果見表4，再通過GraphPad Prism7軟件繪制血藥濃度-時間曲線，見圖2。由此可知，與生品組比較，炮制品組王不留行黃酮苷MRT0～24 h、t1/2縮短(P<0.05)；異牡荊素-2″-O-阿拉伯糖苷Cmax、AUC0～24 h升高(P<0.05)，MRT0～24 h、t1/2縮短(P<0.05)；肥皂草苷MRT0～24 h縮短(P<0.05)。

表4 各黃酮苷主要藥動學參數

圖2 各黃酮苷血藥濃度-時間曲線Fig.2 Plasma concentration-time curves for various flavonoid glycosides n=6)

3 討論

本實驗首次建立了UPLC-MS/MS法同時測定大鼠血漿中王不留行黃酮苷、肥皂草苷和異牡荊素-2″-O-阿拉伯糖苷的含量，并對灌胃給予相同生藥量的大鼠在各時間點的血藥濃度進行測定。表4、圖2顯示，與生品組比較，炮制品組峰濃度、AUC0～24h均顯著升高，平均駐留時間、半衰期顯著降低，表明王不留行炮制后異牡荊素-2″-O-阿拉伯糖苷含量升高，在服用相同劑量提取物時其暴露量增加，消除時間加快；王不留行黃酮苷、肥皂草苷平均駐留時間顯著縮短，并且前者半衰期也顯著縮短，后者半衰期也有相同趨勢，表明炮制品組大鼠體內兩者消除加快。

分析給藥劑量時發現，炮制品組異牡荊素-2″-O-阿拉伯糖苷劑量是生品組的2.24倍，達峰濃度、藥時曲線下面積分別升高約2.5、1.8倍；王不留行黃酮苷、肥皂草苷給藥劑量接近，在吸收程度上也無顯著差異，推測炮制后前者暴露量增加可能是由于劑量導致的，炮制使王不留行中該成分含量增加，可能是導致其暴露程度增加的原因之一。在化學結構上，異牡荊素-2″-O-阿拉伯糖苷7位碳上取代基與王不留行黃酮苷不同，前者為羥基，后者為葡萄糖，而炮制升溫過程會使糖苷鍵斷裂，導致后者向前者轉化。其他王不留行黃酮苷類衍生物也可能為這一轉化提供物質基礎，至于其他因素是否影響異牡荊素-2″-O-阿拉伯糖苷的吸收還需進一步驗證。

前期預實驗選取了刺桐堿、尿囊素、王不留行黃酮苷類、王不留行環肽類、stigmast-7,22-dien-3-ol-3β-O-(β-D-glucopyranoside)、segetoside A 等11種成分，分別在正、負離子模式下對入血成分進行篩選，發現負離子模式不適合做定量分析；正離子模式所測3種黃酮苷響應值均較好，二其他成分響應值過低，不適合被檢測。