柚皮素-PLGA納米粒的制備及其體內(nèi)藥動學(xué)研究

王曉明， 張智強(qiáng)

(1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 鄭州 450064；2.天津藥物研究院藥業(yè)有限責(zé)任公司，天津 300301)

柚皮素是一種廣泛存在于蕓香科植物中的二氫黃酮類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、預(yù)防動脈粥樣硬化、抗纖維化等活性[1]。常溫下柚皮素在水中的溶解度僅為44.52 μg/mL[2]，可能使得藥物難以溶出，進(jìn)而導(dǎo)致口服吸收生物利用度低下[3]，藥效大打折扣。目前，柚皮素制劑新技術(shù)有脂質(zhì)體[4]、納米混懸劑[3]、自微乳[5]、磷脂復(fù)合物[6]等報(bào)道。

納米制劑作為一種固體膠粒給藥系統(tǒng)，可顯著促進(jìn)藥物體外溶出及體內(nèi)口服吸收，是大有發(fā)展前景的新型給藥系統(tǒng)之一，其中聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)作為藥物載體或組織工程材料受到了廣泛關(guān)注[7-8]，已通過FDA認(rèn)證，正應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并作為藥物輔料正式收錄于《美國藥典》。本實(shí)驗(yàn)采用操作簡單、成本低廉的納米沉淀法將柚皮素制成PLGA納米粒，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)得到最優(yōu)處方，再對其凍干粉末體外釋放及體內(nèi)藥動學(xué)進(jìn)行考察，以期為相關(guān)新技術(shù)開發(fā)提供參考。

1 材料

安捷倫1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；AR2240型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；QL-901型渦旋混合器(上海之信儀器有限公司)；MS-S/MS7-S型磁力攪拌器(北京大龍磁力攪拌器)；JC-S12型方形水浴氮?dú)獯祾邇x(青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司)；Nanosep?超濾離心管(截留相對分子質(zhì)量10 000，美國Pall公司)；TL-ST150型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(江蘇天令羽儀器公司)；Master-sizer型粒度分析儀(英國馬爾文公司)；透析袋(美國Sigma公司，相對分子質(zhì)量8～14 kDa)。

柚皮素原料藥(批號170216S，純度>98%，武漢貝爾卡生物醫(yī)藥有限公司)；柚皮素對照品(批號110867-201607，純度99.5%，中國食品藥品檢定研究院)；聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA，型號75∶25、60∶40、50∶50，上海市協(xié)泰化工有限責(zé)任公司)；泊洛沙姆188(批號WPE1566D，德國巴斯夫公司)。

清潔級SD大鼠，雌雄兼具，購自河南省動物實(shí)驗(yàn)中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(豫)2016-0001，于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)至體質(zhì)量為(300±20)g。

2 方法與結(jié)果

2.1 柚皮素-PLGA納米粒制備 由于柚皮素在大多數(shù)溶劑中的溶解度較差，只在丙酮中易溶，而且PLGA在該溶劑中也易溶，故選擇丙酮作為有機(jī)相溶劑。參考文獻(xiàn)[9]報(bào)道，稱取20 mg柚皮素和一定量PLGA溶于5 mL丙酮中，作為有機(jī)相；取一定體積分?jǐn)?shù)泊洛沙姆188溶液加到圓底燒瓶中，水浴加熱至40 ℃并磁力攪拌，作為水相，用5號針頭注射器吸取有機(jī)相，采用液下方式注入水相中，超聲處理20 min，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法濃縮45 min，迅速放入-20 ℃冰箱中進(jìn)行固化，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得，蒸餾水定容，形成混懸液。

2.2 柚皮素含量測定

2.2.1 色譜條件 Waters C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.5%甲酸(78∶22)；體積流量1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測波長271 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密稱取柚皮素對照品10.00 mg，置于10 mL量瓶中，加入乙腈超聲溶解，定容，作為貯備液(1.0 mg/mL)，精密量取1.0 mL至10 mL量瓶中，流動相定容至刻度，逐步稀釋至0.05、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以柚皮素峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=3.548 2X-0.100 4(r=0.999 9)，在0.05～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 供試品溶液制備及方法學(xué)考察 精密量取2 mL柚皮素-PLGA納米粒混懸液，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加入適量乙腈破乳，流動相定容，0.45 μm微孔濾膜過濾，取2 mL續(xù)濾液至10 mL量瓶中，流動相定容，即得供試品溶液。

取同一份混懸液，平行制備6份供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得柚皮素RSD為1.39%，表明該方法重復(fù)性良好。取供試品溶液適量，同一天在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得日內(nèi)精密度RSD分別為0.22%、0.14%、0.39%；連續(xù)6 d，每天1次，測得日間精密度RSD分別0.77%、0.38%、0.42%，表明該方法精密度良好。取混懸液2 mL，加入貯備液0.5、1.0、1.5 mL各3份，加入乙腈超聲溶解，流動相補(bǔ)充減失的質(zhì)量，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得柚皮素平均加樣回收率分別為99.48%、99.16%、99.51%，RSD分別為1.96%、0.89%、0.47%。

2.3 包封率、載藥量測定 量取2.0 mL混懸液至超濾離心管中，12 500 r/min離心60 min，取續(xù)濾液，HPLC法測定游離柚皮素含量(m2)；精密量取2.0 mL混懸液至50 mL量瓶中，加入適量乙腈破壞納米粒，流動相定容，過0.45 μm微孔濾膜，取2 mL續(xù)濾液至10 mL量瓶中，流動相定容后測定柚皮素總含量(m1)，計(jì)算包封率、載藥量，公式分別為包封率=[(m1-m2)/m1]×100%、載藥量=[(m1-m2)/m總]×100%，其中m總為PLGA、柚皮素總質(zhì)量。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 PLGA型號 固定柚皮素用量20 mg，藥物與載體比例1∶15，表面活性劑(泊洛沙姆188)用量0.5%，考察PLGA型號75∶25、60∶40、50∶50對包封率、載藥量、粒徑、PDI、Zeta電位的影響，結(jié)果見表1。由此可知，不同型號PLGA制備時上述指標(biāo)差異較大。

表1 PLGA型號對包封率、載藥量、粒徑、PDI、Zeta電位的影響(n=3)

2.4.2 藥物與載體比例 固定柚皮素用量20 mg，泊洛沙姆188質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，考察藥物與載體比例1∶12、1∶15、1∶18對載藥量、包封率、粒徑、PDI、Zeta電位的影響，結(jié)果見表2。由此可知，隨著載體比例增加，包封率先明顯升高后趨緩，繼續(xù)增加時載藥量下降明顯，但對PDI、Zeta電位無明顯影響[10]；兩者比例為1∶15時包封率、載藥量較高，粒徑、PDI、Zeta電位也較理想。

表2 藥物與載體比例對包封率、載藥量、粒徑、PDI、Zeta電位的影響(n=3)

2.4.3 油相與水相比例 固定柚皮素用量20 mg，藥物與載體比例1∶15，泊洛沙姆188質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，考察油相與水相比例1∶6、1∶8、1∶10對載藥量、包封率、粒徑、PDI、Zeta電位的影響，結(jié)果見表3。由此可知，當(dāng)水相比例過大時，包封率、載藥量下降幅度較大，可能是在表面活性劑增溶作用下藥物轉(zhuǎn)移至水相中所致；隨著水相增加，粒徑有下降趨勢，而對PDI、Zeta電位無明顯影響；當(dāng)兩者比例為1∶8時，上述指標(biāo)均較理想。

表3 油相與水相比例對包封率、載藥量、粒徑、PDI、Zeta電位的影響(n=3)

2.4.4 泊洛沙姆188質(zhì)量分?jǐn)?shù) 合適的表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對納米粒聚集有阻滯作用[11]。固定柚皮素用量20 mg，藥物與載體比例1∶15，油相與水相比例1∶8，考察泊洛沙姆188質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、0.75%、1.0%對載藥量、包封率、粒徑、PDI、Zeta電位的影響，結(jié)果見表4。由此可知，泊洛沙姆188質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時，載藥量、包封率降低，可能是由于其增溶作用使大量藥物進(jìn)入水相，導(dǎo)致載體未能有效包裹藥物；隨著其質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加，粒徑有減小趨勢，但對PDI、Zeta電位無明顯影響；當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%時，上述指標(biāo)均較理想。

表4 泊洛沙姆188質(zhì)量分?jǐn)?shù)對包封率、載藥量、粒徑、PDI、Zeta電位的影響(n=3)

2.5 正交試驗(yàn) 包封率是保證制劑安全有效的重要基礎(chǔ)，也是PLGA納米給藥系統(tǒng)中重要的設(shè)計(jì)參數(shù)[12]，故正交試驗(yàn)以其為評價(jià)指標(biāo)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇PLGA型號(A)、藥物與載體比例(B)、油相與水相比例(C)、泊洛沙姆188質(zhì)量分?jǐn)?shù)(D)作為影響因素，因素水平見表5，結(jié)果見表6，方差分析見表7。由此可知，各因素影響程度依次為A>D>C>B，A有顯著影響(P<0.05)；最優(yōu)處方為A1B1C2D2，即PLGA型號75∶25，藥物與載體比例1∶14，油相與水相比例1∶8，泊洛沙姆188質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.75%。

表5 因素水平

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 取混懸液適量，蒸餾水按1∶4比例稀釋后放入比色池中，測定粒徑、Zeta電位，結(jié)果見圖1～2，可知平均粒徑為(203.51±8.14)nm，PDI為0.193±0.021，Zeta電位為(-34.2±3.0)mV。再按“2.3”項(xiàng)下方法測定包封率、載藥量，測得兩者分別為(84.06±1.66)%、(5.21±0.53)%，表明所得柚皮素-PLGA納米粒分布均勻，包封率高，重復(fù)性好。

表6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表7 方差分析

圖1 柚皮素-PLGA納米粒粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of naringenin-PLGA nanoparticles

圖2 柚皮素-PLGA納米粒Zeta電位Fig.2 Zeta potential of naringenin-PLGA nanoparticles

2.7 凍干粉制備

2.7.1 冷凍干燥工藝 在混懸液中加入凍干保護(hù)劑，溶解混勻后轉(zhuǎn)移至西林瓶中，放到冷凍干燥機(jī)內(nèi)，在-40 ℃下預(yù)凍6 h，開啟真空泵，保持3 h，4 h內(nèi)溫度升至-25 ℃，保持3 h，4 h內(nèi)升溫至-15 ℃，保持3 h，4 h內(nèi)升溫至0 ℃，保持3 h，12 h內(nèi)升溫至25 ℃，保持3 h，即得，取出后迅速密封。見圖3。

圖3 凍干粉外觀Fig.3 Appearance of lyophilized powder

2.7.2 凍干保護(hù)劑種類篩選 本實(shí)驗(yàn)選擇甘露醇、乳糖、蔗糖進(jìn)行考察，并考察其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、5%、6%時對粒徑、包封率的影響，結(jié)果見表8。由此可知，以4%甘露醇為凍干保護(hù)劑時，粒徑、包封率變化程度最小。

表8 凍干保護(hù)劑種類對粒徑、包封率的影響(n=3)

2.8 體外釋藥研究 取柚皮素及其PLGA納米粒凍干粉適量，空白溶出介質(zhì)制成混懸液后置于透析袋中(柚皮素含量為20 mg)，兩端扎緊，以0.75%SDS溶液為釋放介質(zhì)(達(dá)漏槽條件)，設(shè)定體積為900 mL，轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度為(37±1) ℃，在預(yù)定時間點(diǎn)各取樣3 mL，同時補(bǔ)加3 mL 0.75%SDS溶液，計(jì)算藥物釋放量，繪制體外釋放曲線，結(jié)果見圖4。由此可知，原料藥在8 h累積釋放度基本達(dá)到最大，但仍不足30%；PLGA納米粒在各時間點(diǎn)的累積釋放度均高于原料藥，36 h內(nèi)達(dá)到81.07%，體外釋藥符合Weibull模型，見表9。

2.9 藥動學(xué)研究

2.9.1 灌胃液制備及大鼠采血 取凍干粉適量(以柚皮素計(jì)10 mg)，加入3 mL蒸餾水搖勻，即得灌胃液；另取柚皮素10 mg，同法制備相應(yīng)灌胃液。取12只大鼠，隨機(jī)分為2組，每組6只，灌胃給藥(40 mg/kg)，柚皮素組于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10 h眼眶采血，柚皮素-PLGA納米粒組于0、0.5、1、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12 h眼眶采血，采血量均約為0.25 mL，將血樣置于肝素化的離心管中搖勻以防止凝血，2 500 r/min離心5 min，取上層淺黃色血漿，置于-20 ℃冰箱中，測定前室溫解凍。

圖4 柚皮素體外釋放曲線(n=6)Fig.4 In vitro release curves for naringenin (n=6)

表9 柚皮素釋藥模型擬合結(jié)果

2.9.2 血漿樣品處理 參考文獻(xiàn)[3]報(bào)道的方法，并略作調(diào)整。取100 μL血漿樣品至離心管中，加入1.5%甲酸50 μL，振蕩后加入2 mL乙酸乙酯，渦旋6 min得混懸液，8 000 r/min離心20 min，分離上層乙酸乙酯至2 mL離心管中，置于45 ℃氮吹儀中吹干，于殘?jiān)屑尤?00 μL乙腈復(fù)溶。

2.9.3 方法學(xué)考察 取5.0 μg/mL對照品溶液，乙腈稀釋至1 500、1 000、500、100、50、25 ng/mL，分別取100 μL，置于45 ℃氮吹儀中吹干，于殘?jiān)屑尤?00 μL空白血漿，即得血漿對照品溶液，按“2.9.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以柚皮素峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=0.025 4X+2.617 6(R2=0.990 7)，在25～1 500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

取血漿樣品適量，于0、4、8、12、16、24 h在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得柚皮素峰面積RSD為1.42%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取25、500、1 500 ng/mL血漿對照品溶液適量，同一天在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得日內(nèi)精密度RSD分別為1.92%、1.55%、1.02%；連續(xù)6 d，每天1次，測得日間精密度RSD分別為5.92%、5.14%、6.63%，表明該方法精密度良好。取上述3種質(zhì)量濃度血漿對照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得柚皮素平均加樣回收率分別為92.93%、100.48%、96.17%，RSD分別為5.16%、4.04%、3.48%。

2.9.4 結(jié)果分析 圖5、表10顯示，與原料藥比較，PLGA納米粒tmax延長(P<0.01)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，相對生物利用度增加至4.12倍。

圖5 柚皮素血藥濃度-時間曲線(n=6)Fig.5 Plasma concentration-time curves for naringenin (n=6)

表10 柚皮素主要藥動學(xué)參數(shù)

3 討論

納米混懸劑粒徑在200 nm左右時，可有效通過腸道Peyer’s patch進(jìn)入血液循環(huán)，從而獲得較高生物利用度[13-14]。單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，柚皮素-PLGA納米粒的粒徑均在200 nm左右，而且PDI值均小于0.3，表明粒徑分布較為均一[15]，故正交試驗(yàn)只選擇包封率作為評價(jià)指標(biāo)。

王元文[4]制備的柚皮素脂質(zhì)體包封率較低，僅為72.2%，采用自微乳技術(shù)[5]盡管可提高溶解度，促進(jìn)藥物吸收，但需用大量表面活性劑或助表面活性劑，存在一定安全隱患。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，柚皮素-PLGA納米粒包封率達(dá)(84.06±1.66)%，并且表面活性劑用量大大降低；相對口服吸收生物利用度增加至4.12倍，可能是由于制成PLGA納米粒后能促進(jìn)藥物溶出；t1/2由(2.76±0.41)h延長至(5.83±0.73)h，增加了藥物體內(nèi)循環(huán)時間；納米藥物可通過腸道Peyer’s patch進(jìn)入體循環(huán)[16]，有助于降低首過效應(yīng)[17]，促進(jìn)藥物高效吸收；tmax顯著延后，可能是由于PLGA納米粒粘附于胃腸道壁或滯留于絨毛間隙，最終延緩了藥物吸收[18]。