超聲輔助提取西藏凹乳芹總黃酮工藝的優化

李 陽， 余曉暉， 郭 玫， 杜 弢*

[1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校中(藏)藥化學與質量研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000]

西藏凹乳芹Vicatiathibeticade Boiss.是常用藏藥，也為藏藥基礎方五大根藥之一，主要分布于我國云南西北部、四川西部、西藏等地，以西南地區最為集中[1]，其干燥根在當地民間被作為當歸的替用品，也常作為營養蔬菜用于燉肉、燉雞等, 并且鮮品還可生吃，風味獨特[2]。近年來研究表明，西藏凹乳芹含有多種類型成分，如黃酮、香豆素、甾體類、酚酸等[3-5]，具有抗疲勞、抗缺氧、耐高溫等生物活性，在滋補性功能的食品開發和藥用價值方面具有較大的開發潛力及應用前景[6-9]。

目前，西藏凹乳芹總黃酮的提取方法大多為回流提取，而本實驗采用超聲輔助提取，并且采用Box-Behnken響應面法篩選最優工藝，以期為該藥材后續研究提供更深入的理論依據和實踐指導。

1 材料

1.1 試劑與藥物 西藏凹乳芹引種自西藏，產于甘肅中醫藥大學和政藥用植物園，經甘肅中醫藥大學藥學院杜弢教授鑒定為傘形科凹乳芹屬植物西藏凹乳芹Vicatiathibeticade Boiss.的根。蘆丁對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號Y19N7S25244)。無水乙醇(分析純，批號20190215)、氫氧化鈉(分析純，批號20161102)、硝酸鋁(分析純，批號20160411)(天津大茂試劑有限公司)；亞硝酸鈉(分析純，天津市化學試劑三廠)；水為超純水。

1.2 儀器 電子天平(萬分之一，北京賽多利斯儀器系統有限公司)；超聲波清洗儀(型號KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；粉碎機(型號LG-500A，瑞安市百信藥機械廠)；紫外可見分光光度計(型號UV-2401PC，上海元析儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取蘆丁對照品12.5 mg，置于25 mL量瓶中，70%乙醇超聲提取并微熱以使其溶解，放冷，定容，得到質量濃度為0.5 mg/mL的貯備液，精密吸取2、4、6、8 mL至10 mL量瓶中，70%乙醇定容，即得(質量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)。

2.1.2 檢測波長選擇 參考文獻[10-12]報道，精密吸取0.2 mg/mL對照品溶液2 mL，加入5% NaNO2溶液1 mL，置于25 mL量瓶中，搖勻，靜置6 min，加入10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加入5 mL 10%NaOH溶液，70%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min，在400～600 nm 波長處掃描，發現在510 nm處存在最大吸收，故選擇其作為測定波長。

2.1.3 供試品溶液制備 將藥材粉碎后過40目篩，封裝于塑料袋中，置于陰涼干燥處，準確稱取一定量粉末，用一定體積分數乙醇在一定超聲功率下提取，抽濾，抽濾液置于100 mL量瓶中，一定體積分數乙醇定容至100 mL，即得。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取“2.1.1”項下5種質量濃度對照品溶液各2 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.1.2”項下方法測定吸光度。以吸光度為縱坐標(A)，蘆丁質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得方程為A=11.938X+0.038 1(R2=0.997 5)，在0.008～0.04 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取0.2 mg/mL對照品溶液2 mL，按“2.1.2”項下方法測定吸光度6次，測得其RSD為0.64%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 精密稱取藥材粉末適量，在超聲功率180 W、提取溫度30 ℃條件下用5倍量70%乙醇提取2次，每次15 min，提取液抽濾后定容至1010 mL，按“2.1.2”項下方法測定吸光度，每隔30 min測定1次，持續3 h，測得其RSD為1.44%，表明溶液在3 h內穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗 精密稱取同一批藥材粉末4.0 g，平行5份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下方法測定吸光度，測得其RSD為2.13%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取藥材粉末2.0 g，平行6份，分別精密加入1.02 mg/mL對照品溶液15 mL，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項下方法測定吸光度，測得其平均加樣回收率為97.70%，RSD為2.52%。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數 精密稱取4.0 g藥材，平行5份，固定液料比5∶1，提取時間15 min，提取次數2次，超聲功率180 W，提取溫度30 ℃，在乙醇體積分數50%、60%、70%、80%、90%條件下進行提取，提取液過濾后定容，按“2.1.2”項下方法測定吸光度，平行3次，結果見圖1。由此可知，總黃酮含量隨著乙醇體積分數增加呈先升后降的趨勢，在70%、80%時無明顯差異，但在90%時反而有所降低，其原因可能是大量醇溶性雜質浸出，從而影響黃酮在細胞中的滲透。

圖1 乙醇體積分數對總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the content of total flavonoids

2.2.2 液料比 精密稱取4.0 g藥材，平行5份，固定提取時間15 min，提取次數2次，超聲功率180 W，超聲溫度30 ℃，乙醇體積分數70%，在液料比2.5∶1、5∶1、7.5∶1、10∶1、12.5∶1條件下進行提取，提取液過濾后定容，按“2.1.2”項下方法測定吸光度，平行3次，結果見圖2。由此可知，總黃酮含量隨著液料比增加呈先升后降的趨勢，在5∶1時最高。

圖2 液料比對總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the content of total flavonoids

2.2.3 超聲功率 精密稱取4.0 g藥材，平行6份，固定液料比5∶1，提取時間15 min，提取次數2次，乙醇體積分數70%，提取溫度30 ℃，在超聲功率90、120、150、180、210、240 W條件下進行提取，提取液過濾后定容，按“2.1.2”項下方法測定吸光度，平行3次，結果見圖3。由此可知，總黃酮含量隨著超聲功率增加逐漸升高，在150～210 W時更明顯，在210 W時最高，但在210～240 W時反而逐漸降低，這可能是由于能量提高后被提取成分及其他雜質發生了復雜的物理和化學變化所致。

圖3 超聲功率對總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the content of total flavonoids

2.3 Box-Behnken響應面法 在單因素試驗基礎上，選擇乙醇體積分數(X1)、液料比(X2)、超聲功率(X3)作為影響因素，總黃酮含量(Y)作為評價指標，含有5個中心點、17個試驗點[13]，因素水平見表1，結果見表2。

表1 因素水平

表2 試驗設計與結果

表3 方差分析

響應面分析見圖4。由圖4A可知，當乙醇體積分數恒定時，總黃酮含量隨著液料比增加而升高，但趨勢相對平坦；液料比不變時，總黃酮含量隨著乙醇體積分數增加也呈升高趨勢，但達到一定程度后反而降低，在75%～82%時更明顯，并有最高值。由圖4B可知，當液料比恒定時，總黃酮含量隨著超聲功率增加呈升高趨勢；當功率不變時，總黃酮含量隨著液料比增加而升高，但達到一定程度后反而有所降低。由圖4C可知，當乙醇體積分數恒定時，總黃酮含量隨著超聲功率增加先升后降，并且趨勢相對緩慢；超聲功率不變時，總黃酮含量隨著乙醇體積分數增加先升后降，曲面平坦，響應值變化較小。

圖4 各因素響應面圖Fig.4 Response surface plots for various factors

最終確定，最優工藝為乙醇體積分數81.96%，液料比4.89∶1，超聲功率203.78 W。考慮到實際操作可行性，將其修正為乙醇體積分數82%，液料比5∶1，超聲功率200 W，總黃酮含量為7.94 mg/g。

2.4 驗證試驗 取藥材3份，按照優化工藝進行驗證試驗。結果，總黃酮含量分別為7.63、7.82、7.76 mg/g，平均7.74 mg/g，與預測值7.94 mg/g接近。

3 討論

西藏凹乳芹可增長七精，加強體力，并具有開胃、助消化、抗疲勞、增強免疫、抗氧化、改善學習記憶等藥理作用[14]，開發前景廣闊。但對該藥材藥學方面的研究仍較薄弱, 導致其深度開發利用受到限制。

正交試驗等線性模型的不足之處在于只能分析1個孤立的試驗點，不能給出區域上因素最佳組合和響應最優值；Box-Behnken響應面法可通過多元二次回歸方程來擬合因素和響應值之間的函數關系，連續進行各水平分析，故其預測結果準確性較高[15-16]。本實驗采用單因素試驗結合Box-Behnken響應面法，選擇乙醇體積分數、液料比、超聲功率作為評價指標優化西藏凹乳芹總黃酮超聲輔助提取工藝，驗證試驗表明該工藝穩定可行，對今后合理開發利用該藥材具有指導意義。