HPLC-DAD法同時測定復方甘草片中3種有效成分和5種防腐劑

張 筱， 隋海山*， 李現菊， 楊麗蓉， 齊衍超， 張秀霞

(1.濰坊市檢驗檢測中心，山東 濰坊 261000；2.高密市人民醫院，山東 高密 261500)

復方甘草片為多組分組成的中藥復方制劑，方中甘草浸膏為保護性鎮咳祛痰劑[1-3]，主要成分甘草皂苷、甘草黃酮活性較強，其中皂苷類成分甘草酸、甘草次酸在甘草中含量較高，超過2%，而黃酮類成分甘草苷具有抗潰瘍、抗菌、抗炎、鎮痛等作用[4-5]。2020年版《中國藥典》二部[6]收載了復方甘草片中甘草酸的含量測定，但未對其他有效成分進行控制，而且流動相系統含鹽量高，色譜柱損耗快。另外，現行標準未對復方甘草片中苯甲酸鈉的添加量進行控制，存在濫用防腐劑等風險。

近幾年來，復方甘草片中多種有效成分的含量測定多有報道[7-16]，但鮮有同時測定防腐劑含量的研究。因此，本實驗建立HPLC-DAD法同時測定復方甘草片中有效成分甘草酸、甘草苷、甘草次酸，以及防腐劑苯甲酸鈉、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯的含量，以期為該制劑質量控制提供參考。

1 材料

Agilent 1260Ⅱ高效液相色譜儀，配置四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、DAD檢測器、Open LAB CDS 2.X化學工作站(美國Agilent公司)；XSE205DU電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；超聲儀。甘草酸銨(批號110731-202021，純度96.2%)、苯甲酸鈉(批號100433-201702，純度99.7%)、甘草苷(批號111610-201907, 純度93%)、甘草次酸(批號110723-201715, 純度99.6%)、羥苯甲酯(批號100278-201705，純度100%)、羥苯乙酯(批號100847-201604，純度99.9%)、羥苯丙酯(批號100444-201804，純度99.60%)、羥苯丁酯(批號190010-201001，純度99.70%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。復方甘草片共10批(批號1903004、171134、171128、1802001、180509、1903015、1803014、1811029、1903019、1810007)，來源于山東省市場監督管理局抽樣。甲醇、乙腈為色譜純；磷酸二氫鉀為分析純；水為超純水。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，50%甲醇溶解，稀釋成每1 mL分別含甘草酸、苯甲酸鈉、甘草苷、甘草次酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯1.5、0.4、0.2、0.04、0.05、0.05、0.05、0.04 mg的溶液(1)。另取上述各對照品適量，同法制成每1 mL分別含上述成分2.5、0.5、0.15、0.05、0.05、0.05、0.05 g、0.04 mg的溶液(2)。

2.1.2 供試品溶液 取本品10片，研細，精密稱取適量(約1片量)，置于50 mL量瓶中，加50%甲醇超聲提取30 min，放冷，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按處方比例,制備缺甘草浸膏粉、苯甲酸鈉的陰性樣品，按“2.1.2”項下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 Shim-pack GIST C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀，梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長240 nm(檢測苯甲酸鈉、甘草苷)、254 nm(甘草酸、甘草次酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯)；進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.3 專屬性試驗 精密吸取“2.1.1”項下對照品(1)(稀釋10倍)、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，各成分理論塔板數均大于3 000，與相鄰峰的分離度均大于1.5，雜質對被測成分無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液(1)0.2、0.5、1.0、2.5、5、10 mL，置于10 mL量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成6個質量濃度，在“2.2”項色譜條件下各進樣測定2次。以各成分質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，另外羥苯類防腐劑作為處方外非法添加成分篩查的目標物，需對方法檢出限和定量限作進一步考察，故取本品(不含羥苯類防腐劑)作為空白基質，進行低質量濃度水平添加后逐級稀釋，以信噪比(S/N)為3計算檢出限(LOD)，為10計算定量限(LOQ)，結果見表2，可知各有效成分及防腐劑在各自范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗 取“2.1.1”項下對照品溶液(1)適量，50%甲醇稀釋10倍，在“2.2”項色譜條件下進樣測定6次，測得甘草酸、苯甲酸鈉、甘草苷、甘草次酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯峰面積RSD分別為0.8%、0.6%、1.2%、1.8%、0.9%、1.5%、1.4%、0.9%，相對保留時間RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

1.苯甲酸鈉 2.甘草苷 3.羥苯甲酯 4.甘草酸 5.羥苯乙酯 6.羥苯丙酯 7.羥苯丁酯 8.甘草次酸1.sodium benzoate 2. liquiritin 3. methyl hydroxybenzoate 4. glycyrrhizic acid 5. ethyl hydroxybenzoate6. propyl hydroxybenzoate 7. butyl hydroxybenzoate 8. glycyrrhetinic acid圖1 各有效成分、防腐劑HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various effective constituents and preservatives

表2 各有效成分、防腐劑線性關系

2.6 重復性試驗 取本品(批號1903015)細粉6份，每份各約0.15 g(約1片量)，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，測得甘草酸、苯甲酸鈉、甘草苷、甘草次酸含量RSD分別為1.0%、0.8%、1.3%、1.8%，而羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯均未檢出，表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、12、24 h在“2.2”項色譜條件下進樣測定，測得甘草酸、苯甲酸鈉、甘草苷、甘草次酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯峰面積RSD分別為0.8%、0.9%、1.2%、2.0%、1.8%、 1.4%、0.6%、0.9%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 稱取各成分含量已知(甘草酸、苯甲酸鈉、甘草苷、甘草次酸分別為10.1、1.99、0.65、0.23 mg/片，均不含羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯)的本品(批號1903004)細粉6份，每份各約0.5片量，精密稱定，置于50 mL量瓶中，精密加入“2.1.1”項下對照品溶液(2)2 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，甘草酸、苯甲酸鈉、甘草苷、甘草次酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯平均加樣回收率分別為99.1%、95.4%、98.9%、99.6%、98.4%、100.5%、100.0%、96.5%，RSD分別為2.0%、1.2%、2.0%、2.3%、2.0%、1.9%、1.7%、1.6%。

2.9 樣品含量測定 取本品10批，按“2.1.2”項下方法各平行制備3份供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，外標法計算含量，結果見表3，可知各防腐劑均未被檢測出。

表3 各有效成分、防腐劑含量測定結果(mg/片，n=3)

3 討論

3.1 色譜條件篩選 本實驗對Agilent ZORBAX SB C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Shim-pack GIST C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent Eclipse pluss C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱進行考察，發現Shim-pack GIST C18色譜柱對各成分的分離效果最佳。同時，選擇磷酸二氫鉀溶液-乙腈作為流動相，并考察了在不同體積分數磷酸二氫鉀溶液、不同比例流動相下的分離效果，最終采用“2.2”項下色譜條件進行梯度洗脫。

3.2 檢測波長篩選 本實驗采用DAD檢測器進行全波長掃描，發現苯甲酸鈉、甘草苷分別在226、270 nm處有最大吸收，并且兩者在240 nm附近均有較強吸收，同時羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯在256 nm處有最大吸收，甘草酸、甘草次酸在250 nm處有最大吸收。為了使各成分在一次進樣中同時測定，本實驗設定240、254 nm檢測通道，其中苯甲酸鈉、甘草苷選擇前者，其他6種成分選擇后者。

4 結論

本實驗建立HPLC-DAD法同時測定復方甘草片中有效成分甘草酸、甘草苷、甘草次酸，以及防腐劑羥苯甲酯、苯甲酸鈉、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯的含量，該方法準確可靠，可用于該制劑的質量控制。