堅桿火絨草質量標準的研究

趙雪蓮， 李奕松， 蘇宏娜， 譚 玲， 李文兵， 楊正明*， 劉 圓

(1.西南民族大學藥學院，四川 成都 610041；2.四川省羌彝藥用資源保護與利用技術工程實驗室，四川 成都 610225；3.青藏高原民族藥用資源保護與利用國家民委重點實驗室，四川 成都 610225；4.西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041；5.西南民族大學民族醫藥研究院，四川 成都 610041)

堅桿火絨草為菊科植物堅桿火絨草LeontopodiumfranchetiiBeauv.的干燥全草[1]，是藏醫臨床特色外治療法——火灸中的重要原材料，藏藥名“扎瓦”或“扎托巴”[2]，使用歷史悠久，療效確切，收載于《晶珠本草》[3]《藏醫鏡晶本草》[4]《中華藏本草》[5]《藏藥志》[6]《中國藏藥》[7]等藏醫書籍中。火絨草屬植物化學成分較多，主要為有機酸、黃酮、揮發油、倍半萜、苯丙素類、甾體等[8-10]，其中綠原酸具有抗菌、消炎活性[11-12]，3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸還具有抗氧化作用[13]。堅桿火絨草蘊藏量豐富，但尚未建立其質量標準，故本實驗擬對該藥材進行原植物、性狀鑒別、顯微鑒別、薄層鑒別、含量測定、常規項檢查等研究，以期為建立2021年版《四川省藏藥材標準》提供數據支撐。

1 材料

1.1 儀器 DGU-20A液相色譜儀、ATY124電子天平、AUW220D電子天平(日本Shimadzu公司)；潔盟超聲波清洗機(深圳潔盟清洗設備有限公司)。

1.2 試劑與藥物 綠原酸(批號18071907)、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸(批號19061201)對照品(成都普菲德生物技術有限公司)。硅膠GF254薄層板。乙腈、磷酸為色譜純；乙醇及其余試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 藥材 堅桿火絨草共6批，由西南民族大學劉圓教授鑒定為菊科植物堅桿火絨草LeontopodiumfranchetiiBeauv.的干燥全草，具體信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 鑒別

2.1.1 原植物 多年生草本；須根眾多，表皮黑褐色，內質黃白色；根狀莖粗壯，近橫走，有多數密集簇生的花莖和不育的幼莖，無蓮座狀葉叢；莖直立，高15～50 cm，被黃色短柄的密腺，上部還稍有蛛絲狀毛，整株被有具密生的葉；葉直立或稍開展，線形，長約1～3 cm，寬0.1～0.3 cm，有明顯的尖頭，除葉脈和葉基部外，還被有密壓的白色棉毛；苞葉多數，線形，長約5～10 mm，寬1～2 mm；頭狀花序，直徑3～5 mm，10～30個或更多，密集或稍分散；花冠長2～3 mm，淺黃色或灰白色，雄花花冠狹漏斗狀；雌花花冠絲狀；瘦果有短粗毛。花期7～9個月。

2.1.2 性狀 長10～30 cm；根狀莖粗短，木質；須根眾多，表皮黑褐色，內質黃白色；莖直立，圓柱形，質脆，易折斷，密被灰白色棉毛；葉多反卷皺縮，脫落，完整者展開呈線形，頂端有明顯的尖頭，兩面密被白色茸毛；苞葉多數，多反卷皺縮，展開后呈線形，頂端稍鈍或近圓形，兩面密被較厚的黃白色茸毛；頭狀花序密集，冠毛白色；氣微香，味微苦。

2.1.3 顯微 粉末(水合氯醛透化，稀甘油裝片)黃棕色；表皮細胞多呈蝶片狀或不規則狀；氣孔為不定式或平軸式，副衛細胞2～7個；非腺毛單細胞，多彎曲，長56～830 μm，壁較厚，微具細密疣狀突起；薄壁細胞，呈圓形；石細胞單個散在或者數個成群，呈類圓形、類方形、類長形，壁厚、紋孔明顯、胞腔大含黑色內含物，直徑5～10 μm；篩管分子篩板、篩孔明顯；梯紋導管，直徑7～20 μm；螺紋導管多見，直徑10～32 μm；木纖維淡黃色，長梭形，多成束，直徑14～26 μm，壁稍厚，木化；花粉粒眾多，圓球形，直徑23～59 μm，有3個萌發孔，表面密布短刺及細顆粒狀雕紋。見圖1。

注：1～10分別為表皮細胞、氣孔、非腺毛、薄壁細胞、石細胞、篩管、螺紋導管、梯紋導管、木纖維、花粉粒。圖1 堅桿火絨草顯微鑒別Fig.1 Microscopic identification of L. franchetii

2.1.4 TLC定性鑒別 取藥材粉末(過三號篩)2.0 g，加50 mL甲醇加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至5 mL，即得供試品溶液；取綠原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸對照品適量，甲醇制成每1 mL含兩者各1 mg的對照品溶液。按照2020年版《中國藥典》四部通則0502薄層色譜法，吸取上述溶液各10 μL，點于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸丁酯∶甲酸∶水(7∶7∶7)上層溶液為展開劑，展開，晾干，在紫外燈(365 nm)下檢視，結果見圖2。由此可知，供試品在相應對照品位置上顯相同顏色的斑點，而且圖像清晰。

注：R1、R2分別為綠原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸對照品，1～ 6為6批藥材。圖2 堅桿火草TLC色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of L. franchetii

2.2 水分、灰分、浸出物含量測定 按照2020年版《中國藥典》四部通則[14]，對水分(通則0832第四法)、總灰分(通則2302)、酸不溶性灰分(通則2302)、浸出物(通則2201)進行檢查，結果見表2。

表2 水分、灰分、浸出物含量測定結果

2.3 綠原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量測定 參考文獻[15-17]報道。

2.3.1 色譜條件 Kromasi Dimensions C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相乙腈(A)-水(含0.2%磷酸)(B)，梯度洗脫(0～5 min，10%～15%A；5～10 min，15%～20%A；10～35 min，20%A)；體積流量1.2 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長327 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖3。

1.綠原酸 2.3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸1.chlorogenic acid 2.3,5-dicaffeoylquinic acid圖3 各成分HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 供試品溶液制備 取本品粉末(過3號篩)約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 50%乙醇，稱定質量，超聲(功率200 W、頻率40 kHz)處理30 min，放冷，50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.3.3 線性關系考察 精密稱取綠原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸對照品適量，50%乙醇定容至50 mL，得質量濃度分別為0.246、0.332 mg/mL的貯備液，置于4 ℃冰箱中保存，準確吸取適量，制成多個質量濃度，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以各成分質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程分別為綠原酸Y=3×107X+14 481(R2=0.999 9)，在0.009 952～0.124 4 mg/mL范圍內線性關系良好；3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸Y=3×107X-60 903(R2=0.999 9)，在0.008 3～0.166 0 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.4 精密度試驗 精密吸取含0.049 76 mg/mL綠原酸、0.066 4 mg/mL 3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸的對照品溶液10 μL，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得綠原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸峰面積RSD分別為0.20%、0.73%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液(hrc-4)適量，于0、5、10、15、20、30 h在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得綠原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸峰面積RSD分別為0.82%、1.18%，表明溶液在30 h內穩定性良好。

2.3.6 重復性試驗 精密稱取藥材(hrc-4)粉末6份，每份0.5 g，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣10 μL測定，測得綠原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量RSD分別為1.13%、0.89%，表明該方法重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密稱取藥材(hrc-4)粉末6份，每份0.25 g，置于具塞錐形瓶中，加入1.85 mL綠原酸對照品溶液、2.65 mL 3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸對照品溶液、45.5 mL 50%乙醇，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果(n=6)

2.3.8 樣品含量測定 取6批藥材，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，外標法計算含量，結果見表4。

表4 各成分含量測定結果(n=3)

3 討論

3.1 TLC鑒別 本實驗首先考察不同比例乙酸丁酯-甲酸-水(7∶7∶7、7∶5∶5、7∶2.5∶2.5、7∶2.5∶5)的展開體系，發現在7∶7∶7比例下斑點清晰，分離度好。再考察硅膠G板、GF254板、聚酰胺薄膜，發現硅膠GF254板展出斑點分離完全，成像清晰，效果理想。

3.2 水分、灰分、浸出物限量 結合2020年版《中國藥典》四部通則及“藥材和飲片檢定通則”相關要求，暫定堅桿火絨草中水分不得超過13%，總灰分不得超過13%，酸不溶性灰分不得超過6%，浸出物不得少于12%。

3.3 綠原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸限量 6批堅桿火絨草中綠原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量有顯著差異(P<0.01)，以堅桿火絨草干品為計，暫定兩者含量分別不得低于0.14%、0.28%。

4 結論

本實驗填補了藏藥堅桿火絨草質量標準的空白，為制定四川省藏藥材質量標準提供參考。另外，以綠原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸為指標成分時，可降低檢驗成本，增加準確性，提高質量控制可行性。