芪箭消癭方對自身免疫性甲狀腺炎大鼠甲狀腺炎癥損傷的作用

牧亞峰， 左新河,*， 向 楠,*， 趙 勇， 華 川,， 陳繼東,

(1.湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)院甲狀腺疾病診療中心，湖北 武漢 430074)

自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)，也稱為橋本甲狀腺炎，是最常見的自身免疫性甲狀腺疾病。流行病學調(diào)查顯示，AIT患病率為0.03%～0.15%[1],已成為導致原發(fā)性甲狀腺功能減退癥的首要因素[2]。目前，本病尚沒有特效藥物，病情進展為甲減可能需要甲狀腺激素終生替代治療，因此，亟待需要尋找有效的防治方法。

AIT的發(fā)生涉及一系列復雜的致病機制，主要與甲狀腺自身抗體介導、細胞因子失衡、細胞凋亡等病理過程有關。Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)是甲狀腺細胞上廣泛存在的模式識別受體，可通過識別結(jié)合內(nèi)源性分子激活先天免疫應答[3]。經(jīng)配體刺激的TLR4可與下游的髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)結(jié)合，導致核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)激活并產(chǎn)生促炎細胞因子，對免疫應答和炎癥反應過程起重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，TLRs及下游靶標MyD88在AIT患者外周血單個核細胞及血清中高表達[5]。正常大鼠甲狀腺細胞有TLR4及其輔助分子的表達[6]，該證據(jù)表明甲狀腺細胞具有激活先天免疫反應的能力。由此提示，TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活可能參與AIT的發(fā)病機制。

芪箭消癭方是全國名中醫(yī)陳如泉教授治療AIT的經(jīng)驗方，具有較好的臨床療效。本課題前期研究[7]發(fā)現(xiàn)芪箭消癭方能夠降低AIT小鼠TGAb、TPOAb水平，減輕甲狀腺組織淋巴細胞浸潤，改善免疫紊亂狀態(tài)。本實驗在前期研究基礎上，圍繞TLR4/MyD88/NF-κB信號通路探討芪箭消癭方對AIT大鼠作用的潛在機制，為臨床應用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF級6周齡雌性SD大鼠48只，體質(zhì)量 (110±10) g，由三峽大學提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(鄂)2017-0012，飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學實驗動物中心，溫度 (23±2) ℃，相對濕度 (55±10)%，晝夜明暗12 h/12 h，自由攝食飲水。本實驗經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準。

1.2 藥物 芪箭消癭方主要組方藥材為黃芪30 g、白芍15 g、鬼箭羽15 g、穿山龍15 g(江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，由湖北省中醫(yī)院中藥配方顆粒藥房調(diào)配)。硒酵母片(牡丹江靈泰藥業(yè)有限公司，批號H10940161)。

1.3 試劑 豬甲狀腺球蛋白、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑(美國Sigma公司，批號分別為180801、F5881、F5506)；FT3、FT4、IFN-γ、TNF-α試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號分別為0079c、0122c、R0009c、R2856c)；TPOAb試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，批號E11199r)；TGAb試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，批號R0551)；Trizol(美國Ambion公司，批號15596-026)；HiScript Reverse Transcriptase、SYBR Green Master Mix for qPCR(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號分別為R101-01/02、Q111-02)；TLR4、NF-κB p65抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，批號分別為19811-1-AP、13409-1-AP)；MyD88抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號A0980)；IKKβ、p-IKKβ(北京博奧森生物技術有限公司，批號分別為4880R、3232R)；β-actin、山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為BM0627、BA1051、BA1054)。

1.4 儀器 離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)；多功能酶標儀(美國MD公司)；輪轉(zhuǎn)式切片機(德國Leica公司)；熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 造模 采用高碘水喂養(yǎng)聯(lián)合皮下注射豬甲狀腺球蛋白與弗氏佐劑誘導建立AIT大鼠模型[8]。適應性喂養(yǎng)后，自實驗第2～7周分別于大鼠皮下多點予以2次初次免疫、4次加強免疫，每周1次，每次注射豬甲狀腺球蛋白100 μg/只，同時給予碘化鈉水(0.64 g/L)喂養(yǎng)，造模期間大鼠自由飲水。

2.2 分組及給藥 48只大鼠隨機分為對照組、模型組、硒酵母組及芪箭消癭方低、中、高劑量組，每組8只。自實驗第7周開始，對照組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，硒酵母組大鼠給予硒酵母混懸液(36 μg/kg)灌胃，芪箭消癭方低、中、高劑量組大鼠分別給予芪箭消癭方(1.8、3.6、7.2 g/kg)灌胃，每天1次，連續(xù)6周，于實驗第12周結(jié)束后取材，劑量按大鼠與人等效劑量折算系數(shù)換算。

2.3 指標檢測

2.3.1 ELISA法 大鼠采血后靜置1～2 h，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取得血清，按照相關ELISA試劑盒說明書檢測FT3、FT4、TGAb、TPOAb、TNF-α、IFN-γ水平。

2.3.2 HE染色 大鼠采血后冰上快速分離氣管兩側(cè)甲狀腺組織，一部分置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫硪徊糠纸萦?%多聚甲醛中固定，制成4 μm厚切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察拍照。參照Verginis等[9]制定的甲狀腺組織炎癥評分標準對其進行打分，具體為0分，無淋巴細胞浸潤；1分，2個或3個甲狀腺濾泡之間的間質(zhì)可見淋巴細胞浸潤；2分，1個或2個甲狀腺濾泡大小的浸潤灶；3分，廣泛浸潤面積達10%～40%；4分，廣泛浸潤面積達40%～80%；5分，廣泛浸潤面積達80%以上。

2.3.3 RT-qPCR法 Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-qPCR法檢測待測基因，反應條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，40個循環(huán)。反應結(jié)束后進行熔解曲線分析，采用2-ΔΔCT法計算數(shù)據(jù)，以β-actin為內(nèi)參基因，引物由武漢巴菲爾生物技術服務有限公司合成提供，序列見表1。

表1 引物序列

2.3.4 Western blot法 取剪碎的大鼠甲狀腺組織，加入含磷酸酶抑制劑的裂解液后勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液，檢測蛋白濃度。制備10% SDS-PAGE凝膠，蛋白上樣，電泳分離轉(zhuǎn)膜，TBST封閉，將膜浸泡于稀釋后的一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，浸入稀釋后的二抗(1∶50 000)，37 ℃孵育2 h，ECL顯影曝光，掃描膠片，BandScan軟件分析條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 芪箭消癭方對大鼠血清FT3、FT4水平的影響 如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠血清FT3、FT4水平增加(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組大鼠血清FT3、FT4水平減少(P<0.05，P<0.01)。

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖1 各組大鼠血清FT3、FT4水平Fig.1 Serum FT3 and FT4 levels of rats in each group

3.2 芪箭消癭方對大鼠甲狀腺組織病理的影響 如圖2A所示，對照組大鼠甲狀腺濾泡結(jié)構完整，形態(tài)規(guī)則，呈類圓形或多邊形，濾泡上皮細胞呈單層立方形，排列整齊，濾泡腔內(nèi)充滿膠質(zhì)，濾泡間隙未見淋巴細胞浸潤；模型組大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞呈扁平狀，大部分濾泡結(jié)構破壞萎縮，可見彌漫性淋巴細胞浸潤；硒酵母組大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞排列尚整齊，濾泡腔萎縮，膠質(zhì)水平減少，可見吸收空泡；芪箭消癭方各劑量組大鼠甲狀腺濾泡結(jié)構完整性改善，淋巴細胞浸潤明顯減少，病變程度有所減輕。如圖2B所示，與對照組比較，模型組大鼠甲狀腺組織炎癥評分增加(P<0.01)，而各給藥組大鼠甲狀腺組織炎癥評分較模型組降低(P<0.01)。

注：箭頭處為淋巴細胞聚集。與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖2 各組大鼠甲狀腺組織形態(tài)學變化 (HE，×100)Fig.2 Histological changes of rat thyroid in each group (HE，×100)

3.3 芪箭消癭方對大鼠血清TGAb、TPOAb水平的影響 如圖3所示，與對照組比較，模型組大鼠血清TGAb、TPOAb水平升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組大鼠血清TGAb、TPOAb水平降低(P<0.05，P<0.01)。

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖3 各組大鼠血清TGAb、TPOAb水平Fig.3 Serum TGAb and TPOAb levels of rats in each group

3.4 芪箭消癭方對大鼠血清IFN-γ、TNF-α水平的影響 如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠血清IFN-γ、TNF-α水平升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組大鼠血清IFN-γ、TNF-α水平降低(P<0.05)。

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖4 各組大鼠血清IFN-γ、TNF-α水平Fig.4 Serum IFN-γ and TNF-α levels of rats in each group

3.5 芪箭消癭方對大鼠甲狀腺組織TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表達的影響 如圖5所示，與對照組比較，模型組大鼠甲狀腺組織TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表達升高(P<0.01)；與模型組比較，硒酵母組及芪箭消癭方中、高劑量組大鼠甲狀腺組織TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表達降低(P<0.01)。

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖5 各組大鼠甲狀腺組織TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表達Fig.5 mRNA expressions of TLR4, MyD88 and NF-κB p65 of rat thyroid tissue in each group

3.6 芪箭消癭方對大鼠甲狀腺組織TLR4/MyD88/NF-κB相關通路蛋白表達的影響 如圖6所示，與對照組比較，模型組大鼠甲狀腺組織TLR4、MyD88、IKKβ、p-IKKβ、NF-κB p65蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，硒酵母組及芪箭消癭方中、高劑量組大鼠甲狀腺組織TLR4、MyD88、IKKβ、p-IKKβ、NF-κB p65蛋白表達降低(P<0.01)。

注：A為蛋白條帶，B為蛋白表達。與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖6 各組大鼠甲狀腺組織TLR4/MyD88/NF-κB通路相關蛋白表達Fig.6 Expressions of TLR4/MyD88/NF-κB pathway related proteins in rat thyroid tissues of each group

4 討論

自身免疫性甲狀腺炎(AIT)是一種T細胞介導的器官特異性自身免疫性疾病，表現(xiàn)為淋巴細胞浸潤甲狀腺，導致甲狀腺細胞凋亡，并伴有TGAb、TPOAb的產(chǎn)生。異原性抗原免疫法通過攝入過量碘或甲狀腺球蛋白免疫，可使易感大小鼠品系輕松誘發(fā)，是國際公認的AIT經(jīng)典模型之一[10]。本研究模型組大鼠TGAb、TPOAb水平升高，甲狀腺組織形態(tài)結(jié)構破壞且炎癥評分增高，表明AIT動物模型誘導成功。國內(nèi)一項多中心、前瞻性研究發(fā)現(xiàn)補硒治療可以有效降低AIT患者TPOAb水平[11]。目前，硒酵母廣泛應用于AIT的臨床治療，故將其作為陽性對照藥。給予芪箭消癭方后，大鼠血清中TGAb、TPOAb水平及炎癥評分降低，甲狀腺組織炎癥浸潤有不同程度改善，這與前期研究[7]結(jié)果基本一致。當甲狀腺濾泡上皮細胞因炎癥破壞后，儲存在濾泡中的大量甲狀腺激素釋放入血，F(xiàn)T3、FT4可一過性升高[12]，這一現(xiàn)象也在本實驗及文獻[13]中得到證實。經(jīng)芪箭消癭方干預后，F(xiàn)T3、FT4水平下降。有研究表明穿山龍有降低FT3、FT4的作用[14]，說明芪箭消癭方對AIT大鼠甲狀腺功能的抑制作用可能與方中穿山龍的藥理作用有關。

TNF-α和IFN-γ是Th1細胞免疫應答過程中釋放的關鍵細胞因子[15]，而Th1/Th2細胞因子失衡在AIT的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，以Th1細胞因子占主導地位[16-17]。TNF-α是炎癥反應及細胞凋亡的主要介質(zhì)，與IFN-γ廣泛存在于AIT甲狀腺慢性炎癥環(huán)境中[18]。二者協(xié)同作用不僅可以持續(xù)加強AIT的病理過程，還可通過甲狀腺細胞的凋亡誘導甲狀腺組織炎癥損傷[19]。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷TNF-α能夠調(diào)節(jié)AIT大鼠甲狀腺促炎細胞因子的產(chǎn)生及細胞凋亡的表達，有助于甲狀腺組織炎癥消退并抑制其纖維化[20]。本研究模型組大鼠血清TNF-α、IFN-γ水平升高，與上述文獻報道一致。芪箭消癭方干預后，促炎細胞因子水平降低，這和其他中藥研究結(jié)果相似[21]。

炎癥反應是免疫系統(tǒng)與受損組織之間相互作用的結(jié)果，而TLR4/MyD88/NF-κB信號通路則在機體炎癥與免疫的調(diào)節(jié)中扮演重要角色[22,4]。TLR4是人類目前研究最深入的TLRs之一，可通過識別脂多糖、DNA片段等內(nèi)源性分子與胞內(nèi)的MyD88結(jié)合啟動依賴性途徑[23]；NF-κB是引發(fā)下游炎癥的關鍵因素,下游的IKKβ磷酸化后激活IKK，促使NF-κB移位進入細胞核，最終促使TNF-α、IFN-γ等促炎因子表達[24]。而TNF-α又能夠反過來激活NF-κB，啟動TNF-α的轉(zhuǎn)錄，形成環(huán)路加重炎癥損傷[25]。體外研究證實TLR4可在FRTL-5細胞中表達，并能通過識別脂多糖活化NF-κB[26]。后又有學者通過刺激甲狀腺細胞上的TLR4而促進促炎因子的表達[27]。祁崗等[28]發(fā)現(xiàn)AIT大鼠中NF-κB通路的持續(xù)激活可啟動Bcl-2和ICAM-1基因表達，促使炎癥細胞增殖、浸潤甲狀腺組織。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠甲狀腺組織中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關基因及其蛋白表達升高，表明該通路被激活。給予藥物干預后，硒酵母組及芪箭消癭方中、高劑量組TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關基因及其蛋白表達降低，表明該信號通路被抑制。李嫚等[29]也發(fā)現(xiàn)中藥制劑夏枯草膠囊可通過抑制AIT大鼠NF-κB信號通路的活化，改善甲狀腺功能并減輕甲狀腺組織炎癥反應。

AIT在中醫(yī)學中屬“癭病”范疇，病因多與先天稟賦、體質(zhì)因素、水土因素等有關。主要病機為氣郁化火傷及氣陰，遷延日久耗傷正氣，形成氣陰兩虛，氣滯、痰濁、瘀血結(jié)于頸前而成。本病存在虛實夾雜之象，治宜標本兼治；只用益氣扶正，則有形之邪難消；單用活血化痰之藥，難收正本清源之效。因此陳如泉教授主張益氣養(yǎng)陰、活血化痰聯(lián)合應用，使病因消失、病理產(chǎn)物清除，達到正復邪祛[30]，并根據(jù)臨床經(jīng)驗及國內(nèi)外研究成果設立芪箭消癭方，重用甘溫之黃芪為君以益氣扶正；臣以白芍柔肝斂陰；佐以鬼箭羽活血行氣；穿山龍活血之余兼能化痰，共奏益氣養(yǎng)陰，化痰活血之功。

綜上所述，芪箭消癭方可能通過調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路關鍵蛋白的表達，減少促炎細胞因子的產(chǎn)生，改善甲狀腺組織炎癥損傷，起到保護甲狀腺的作用。然而，對于芪箭消癭方調(diào)節(jié)免疫降低抗體水平的其他可能機制以及如何通過復雜通路減少細胞凋亡來改善甲狀腺炎癥損傷，仍需進一步研究。