鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的保護(hù)作用

張 怡， 徐 凡， 金佳琦， 梁秀睿， 張譽(yù)馨， 關(guān) 晶， 傅繼華

(中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

鹿血是鹿科動(dòng)物梅花鹿或馬鹿的血，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其中主要是蛋白質(zhì)，還含有多種有益微量元素[1]。臨床觀察證明鹿血在升高放、化療病人白細(xì)胞有顯著的作用，尤其適用于腫瘤放、化療后白細(xì)胞減少、血小板下降、補(bǔ)充營養(yǎng)、改善惡病質(zhì)。具有延緩衰老，增強(qiáng)免疫，補(bǔ)血，抗疲勞和補(bǔ)腎益精等作用[2]。鹿血及鹿茸血臨床多用于促進(jìn)新陳代謝功能, 增強(qiáng)體質(zhì)[1]。目前已經(jīng)制成茸血精、復(fù)方茸血膠囊等制劑，本實(shí)驗(yàn)用的鹿血晶為鹿血的冷凍干燥制劑。

急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)具有高致病率和致死率，發(fā)生時(shí)腎臟出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激[3]、炎癥[4]與細(xì)胞凋亡[5]，從而導(dǎo)致腎功能下降，臨床上表現(xiàn)為血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(Serum creatinine，Scr)水平的升高、蛋白尿的出現(xiàn)等[6-7]。腫瘤化療藥物的毒副作用常發(fā)生AKI，如順鉑是臨床上常用的腫瘤化療藥物之一，其毒副作用以腎毒性最為嚴(yán)重，可誘發(fā)AKI[8]。由于缺乏有效的藥物治療，腎臟替代治療是目前西醫(yī)治療AKI的主要措施[9]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，AKI的產(chǎn)生主要是“毒為先導(dǎo)、因毒致瘀，毒瘀互結(jié)”，治療上以祛邪扶正，清熱解毒、通腑化濁、活血化瘀、補(bǔ)益脾腎、益氣養(yǎng)陰、回陽救逆等為原則[10]。現(xiàn)代藥理研究顯示，鹿血類制品具有補(bǔ)精益氣的功效[11]，故可能對(duì)腎臟疾病有療效。本實(shí)驗(yàn)通過建立順鉑誘導(dǎo)的小鼠AKI模型，來觀察鹿血晶預(yù)防性給藥對(duì)AKI的抑制效應(yīng)及對(duì)腎臟的保護(hù)作用，以期為鹿血晶的臨床應(yīng)用提供現(xiàn)代藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)ICR雄性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2017-0007，飼養(yǎng)于中國藥科大學(xué)藥學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(玄武校區(qū))[動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(蘇)2016-0011]，于正常實(shí)驗(yàn)條件下喂養(yǎng)，環(huán)境溫度恒溫26 ℃，相對(duì)濕度50%～55%，光照/黑暗12 h/12 h，定期更換墊料及飲用水。所有實(shí)驗(yàn)條件及方案均符合中國藥科大學(xué)藥學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理審查標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 試劑與藥物 鹿血晶凍干粉末(蘇州紅冠莊國藥股份有限公司，批號(hào)L190504)。順鉑(CAS號(hào)15663-27-1)，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Scr(貨號(hào)C011-2-1)、BUN(貨號(hào)C013-2-1)、白蛋白(Albumin，ALB，貨號(hào)A028-2-1)、還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH，貨號(hào)A006-2-1)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA，貨號(hào)A003-1-2)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD，貨號(hào)A001-3-2)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px，貨號(hào)A005-1-2)檢測(cè)試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS，貨號(hào)ml009876)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α，貨號(hào)ml209807)、白細(xì)胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β，貨號(hào)ml063132)酶聯(lián)免疫分析試劑盒，均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(貨號(hào)C1028)，購自上海碧云天生物科技有限公司；NF-κB p65抗體(貨號(hào)WL01273b)、磷酸化NF-κB p65抗體(p-NF-κB p65，貨號(hào)WL02169)、IκBα抗體(貨號(hào)WL01936)、磷酸化IκBα抗體(p-IκBα，貨號(hào)WL02495)、p38抗體(貨號(hào)WL00764)、磷酸化p38抗體(p-p38，貨號(hào)WL03428)、JNK抗體(貨號(hào)WL01295)、磷酸化JNK抗體(p-JNK，貨號(hào)WL01813)、促凋亡蛋白Bax抗體(貨號(hào)WL01637)、抑凋亡蛋白Bcl-2抗體(貨號(hào)WL01556)，購自沈陽萬類生物科技有限公司；凋亡相關(guān)蛋白酶caspase3抗體(貨號(hào)16977-1-AP)、GAPDH抗體(貨號(hào)60004-1-Ig)，購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；凋亡相關(guān)蛋白酶caspase9抗體(貨號(hào)sc-56076)，購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；高敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)E412-01)，購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 儀器 Infinite M2000 Pro全波長酶標(biāo)儀(德國Tecan公司)；IX51型熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Nikon TS2-S-SM倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；Tanon 5200 Multi全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 藥液配制 鹿血晶人臨床用量為2.0 g/d，按體表面積換算[12]為小鼠每天用量為0.26 g/kg。分別取等效用量的1.5、3、6倍作為低、中、高劑量組，每天灌胃給藥2次，則3組劑量分別為每次0.20、0.39、0.78 g/kg。給藥體積為0.2 mL/10 g體質(zhì)量，將鹿血晶溶于0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)中，質(zhì)量濃度分別為9.75、19.5、39 mg/mL。

2.2 分組及給藥 雄性ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(0.5% CMC-Na)，模型組(0.5% CMC-Na)，AKI模型鹿血晶低(0.20 g/kg)、中(0.39 g/kg)、高劑量組(0.78 g/kg)，灌胃給予相應(yīng)藥物。預(yù)給藥7 d (每天2次)后，小鼠禁食不禁水12 h，除對(duì)照組外各組一次性腹腔注射順鉑(25 mg/kg) (對(duì)照組腹腔注射相同體積生理鹽水)造模，繼續(xù)給藥72 h后眼框取血，脫臼處死，取兩側(cè)腎臟稱質(zhì)量，計(jì)算腎指數(shù)，公式為腎指數(shù)=(腎臟濕重/體質(zhì)量)×100%，全血室溫靜置后離心分離獲得血清，4 ℃保存。腎組織-80 ℃保存，另取部分固定在10%甲醛中，用于組織病理學(xué)分析。

2.3 小鼠血清及腎組織生化指標(biāo)檢測(cè) 小鼠血清BUN、Scr、ALB水平，腎臟組織內(nèi)MDA、GSH水平和SOD、GSH-Px活性按相關(guān)試劑盒說明書測(cè)定；腎臟組織內(nèi)ROS、TNF-α及IL-1β水平均采用ELISA法測(cè)定，按照相關(guān)說明書進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 小鼠腎組織蘇木精-伊紅(HE)染色 小鼠腎臟制成常規(guī)石蠟切片，HE染色，由南京爍樸生物科技有限公司完成，在顯微鏡下觀察拍照。

2.5 Hoechst 33342染色 將小鼠腎臟制成常規(guī)石蠟切片，Hoechst 33342染色液稀釋100倍成工作液后染色，由南京爍樸生物科技有限公司完成，在倒置熒光顯微鏡下觀察，于DAPI通道下記錄各組腎臟形態(tài)及細(xì)胞凋亡損傷情況并拍照。

2.6 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)小鼠腎臟組織NF-κB p65、IκBα、p38、JNK總蛋白表達(dá)及其磷酸化(p-)蛋白表達(dá)，以及Bax、Bcl-2、caspase3、caspase9表達(dá)，通過Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)果

3.1 造模成功判斷標(biāo)準(zhǔn) AKI成模后，小鼠腎臟顏色由正常的紫紅色變成蒼白色，兩者顏色差異非常明顯，并且成模小鼠血清肌酐、尿素氮水平明顯升高，而血清ALB水平明顯降低。順鉑注射后，未成模小鼠腎臟顏色與正常腎沒有明顯區(qū)別，上述3個(gè)血清指標(biāo)的變化也較小，尤其是肌酐水平。成模小鼠經(jīng)藥物治療后小鼠腎臟顏色會(huì)明顯改善，但未達(dá)到正常小鼠水平。

本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組有15只小鼠；模型組有19只小鼠，死亡1只，未成模1只，最終17只；AKI模型鹿血晶低劑量組有16只小鼠，死亡0只，未成模1只，最終15只；AKI模型鹿血晶中劑量組有16只小鼠，死亡0只，未成模1只，最終15只；AKI模型鹿血晶高劑量組有17只小鼠，死亡0只，未成模1只，最終16只。

3.2 鹿血晶對(duì)AKI小鼠腎臟顏色、體質(zhì)量、臟器指數(shù)及腎功能的影響 對(duì)照組小鼠腎臟顏色呈紫紅色；模型組小鼠則呈蒼白色(圖1A)。與對(duì)照組比較，模型組小鼠腎指數(shù)(圖1B)升高(P<0.01)，順鉑造模后3 d內(nèi)體質(zhì)量(圖1C)不斷減輕(P<0.01)，進(jìn)食量(圖1D)不斷減少直至不再進(jìn)食；與模型組比較，鹿血晶各給藥組均明顯改善腎臟顏色(尤其是高劑量組)，降低腎指數(shù)(P<0.01)，減小順鉑引起的體質(zhì)量減輕(P<0.05，P<0.01)，并呈劑量依賴性，但各給藥組對(duì)順鉑引起的進(jìn)食量減少無明顯影響(P>0.05)。圖1E～1G顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清Scr、BUN水平升高(P<0.05，P<0.01)，ALB水平降低(P<0.05，P<0.01)；而與模型組比較，鹿血晶各劑量組均可明顯改善腎功能指標(biāo)(P<0.05，P<0.01)，并呈現(xiàn)出劑量依賴性。

注：與對(duì)照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與鹿血晶低劑量組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與鹿血晶中劑量組比較，▲▲P<0.01。圖2 鹿血晶對(duì)AKI小鼠腎組織ROS、MDA水平，SOD、GSH-Px活性及GSH水平的影響Fig.2 Effects of deer blood crystal on the levels of ROS and MDA, activities of SOD and GSH-Px, and level of GSH in renal tissues of AKI

3.3 鹿血晶對(duì)AKI小鼠腎組織氧化應(yīng)激的影響 圖2A～2E顯示，與對(duì)照組比較，AKI小鼠腎組織ROS、MDA水平升高(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性及GSH水平降低(P<0.01)；與模型組比較，鹿血晶治療可明顯改善順鉑誘導(dǎo)的腎臟氧化應(yīng)激(P<0.05，P<0.01)，并呈劑量依賴性。

3.4 鹿血晶對(duì)AKI小鼠腎組織炎癥、組織損傷的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠腎組織出現(xiàn)明顯炎癥，IκBα、NF-κB p65磷酸化表達(dá)(p-IκBα，p-NF-κB p65)升高、IκBα的總表達(dá)降低(圖3A，左)，p-IκBα/IκBα及p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)升高(P<0.01)(圖3A，右)，模型組TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.01)(圖3B～3D)，提示炎癥信號(hào)通路激活、炎癥因子產(chǎn)生增多；與模型組比較，給予鹿血晶后，可明顯抑制AKI小鼠腎臟炎癥信號(hào)通路激活、炎癥因子產(chǎn)生(P<0.05，P<0.01)，并且作用呈劑量依賴性。

與對(duì)照組比較，AKI小鼠腎組織p38、JNK的磷酸化表達(dá)(p-p38、p-JNK)升高(圖3C，左)，p-p38/p38及p-JNK/JNK蛋白相對(duì)表達(dá)升高(P<0.01)(圖3C，右)；而與模型組比較，鹿血晶可劑量依賴性下調(diào)AKI小鼠腎組織p38、JNK磷酸化表達(dá)增加(P<0.05，P<0.01)。圖3E顯示，AKI小鼠腎小管明顯損傷，腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落、管腔變形空泡化；鹿血晶可使腎小管損傷明顯減輕，以高劑量組更明顯。

注：與對(duì)照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與鹿血晶低劑量組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與鹿血晶中劑量組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。圖3 鹿血晶對(duì)AKI小鼠腎組織IκBα、NF-κB p65、p38、JNK磷酸化表達(dá)，TNF-α、IL-1β水平及腎組織損傷的影響(HE染色，F(xiàn)ig.3 Effects of deer blood crystal on the phosphorylation expressions of IκBα, NF-κB p65, p38 and JNK, levels of TNF-α and IL-1β, and injury in renal tissues of AKI mice(HE

3.5 鹿血晶對(duì)AKI小鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，模型組小鼠腎組織促凋亡蛋白Bax、凋亡相關(guān)蛋白酶caspase3、caspase9表達(dá)均上調(diào)(圖4A，左)，相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.01)(圖4 A，右)，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)(圖4A，左)，相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.01)(圖4A，右)。Hoechst 33342染色(圖4B)顯示，對(duì)照組小鼠腎組織細(xì)胞核只出現(xiàn)弱熒光；而模型組小鼠腎小球、腎小管上皮細(xì)胞核內(nèi)熒光強(qiáng)度增大，出現(xiàn)明亮的藍(lán)色熒光，尤以腎小球內(nèi)細(xì)胞特別明顯，提示出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡；與模型組比較，鹿血晶可下調(diào)Bax、caspase3、caspase9蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，腎小球及腎小管上皮細(xì)胞核內(nèi)Hoechst 33342染色熒光強(qiáng)度減輕，并呈劑量依賴性。

注：與對(duì)照組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與鹿血晶低劑量組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與鹿血晶中劑量組比較，▲▲P<0.01。圖4 鹿血晶對(duì)AKI小鼠腎組織Bax、Bcl-2、caspase3、caspase9表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響 (Hoechst 33342染色，F(xiàn)ig.4 Effects of deer blood crystal on the expressions of Bax, Bcl-2, caspase3 and caspase9, and apoptosis in renal tissues of AKI mice (Hoechst 33342

4 討論

AKI是一種危急重癥，表現(xiàn)為在短期內(nèi)腎功能急劇惡化，造成新陳代謝失調(diào)、電解質(zhì)紊亂及液體失衡[13]，且病因復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣，病情變化快[14]。AKI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)有研究認(rèn)為氧化應(yīng)激損傷是AKI機(jī)制中尤為重要的作用環(huán)節(jié)[15]。AKI發(fā)生時(shí)腎組織的抗氧化-氧化系統(tǒng)平衡被破壞，降低腎組織的抗氧化能力，造成腎臟氧化應(yīng)激損傷[16]。AKI發(fā)生時(shí)可導(dǎo)致NF-κB信號(hào)通路激活，從而導(dǎo)致以TNF-α、IL-1β為代表的多種促炎因子及趨化因子水平升高[17]。p38 MAPK信號(hào)通路的激活被視為是AKI的潛在作用機(jī)制[18]，該通路激活后可介導(dǎo)其下游促/抗凋亡蛋白的表達(dá)，如Bax、Bcl-2等[19]。當(dāng)激活促凋亡蛋白并抑制抗凋亡蛋白時(shí)，其下游以蛋白酶caspase3、caspase9等為終末因子的細(xì)胞凋亡應(yīng)答反應(yīng)被徹底激活[20]。腎臟是人體重要的解毒和排泄器官，非常容易受到藥物損害而誘發(fā)AKI。其中，順鉑作為一種臨床上常用的化療藥物，常用于治療多種惡性腫瘤。順鉑大量蓄積于腎臟所致的AKI是治療過程中常見且致命的副作用，其臨床發(fā)生率約為30%，致死率高達(dá)65%[21-22]，且呈逐年上升趨勢(shì)。本研究采用單次腹腔注射順鉑誘導(dǎo)AKI小鼠模型，該模型能較好地模擬臨床上順鉑誘導(dǎo)AKI發(fā)生的病理表現(xiàn)及變化[23]。

鹿血晶作為一種中藥飲片，為鹿血經(jīng)炮制加工凍干后制得的產(chǎn)品，常用于腫瘤放、化療后病人升高白細(xì)胞及血小板，增強(qiáng)免疫力等。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，鹿血晶還有補(bǔ)腎益精，補(bǔ)血補(bǔ)氣，增強(qiáng)性功能的作用[24]。近來有文章報(bào)道，鹿血晶能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬大腸桿菌的能力,并且在不影響細(xì)胞活性的同時(shí)作用于NF-κB信號(hào)通路，抑制炎癥狀態(tài)下巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)與釋放[25]，鹿血晶還能夠活化巨噬細(xì)胞mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子，提升巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬、殺傷能力[26]。本研究表明，鹿血晶對(duì)腎臟也具有明確的保護(hù)作用。鹿血晶預(yù)防性給藥，可以明顯改善順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠腎功能損傷，降低Scr、BUN水平，并升高血清ALB水平；并且，可有效地降低AKI發(fā)生時(shí)腎臟的氧化應(yīng)激水平(抑制腎組織ROS、MDA水平升高，SOD、GSH-Px活性降低及GSH水平降低)、抑制炎癥信號(hào)通路NF-κB激活及炎癥因子TNF-α、IL-1β分泌，還抑制凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase3、caspase9表達(dá)的上調(diào)及抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)的下調(diào)、明顯降低細(xì)胞凋亡的程度。實(shí)驗(yàn)顯示，鹿血晶對(duì)AKI腎臟的這種保護(hù)作用呈現(xiàn)劑量依賴性。經(jīng)由檢測(cè)MAPKs信號(hào)分子p38、JNK磷酸化表達(dá)的改變，推測(cè)鹿血晶對(duì)順鉑誘導(dǎo)AKI的抑制作用，與其抑制p38、JNK磷酸化表達(dá)上調(diào)、抑制NF-κB激活，從而抑制p38、JNK、NF-κB信號(hào)通路激活相關(guān)。鹿血晶的活性成分、作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，鹿血晶具有多方面的臨床作用，不僅能“升高白細(xì)胞及血小板，增強(qiáng)免疫力”，還對(duì)腎臟具有明顯的保護(hù)作用。這為鹿血晶具備的“補(bǔ)腎益精、補(bǔ)血補(bǔ)氣”的功效提供了明確的現(xiàn)代藥理學(xué)證據(jù)，也為其作為一種保健類中藥的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。